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微生物实验无菌操作微生物接种：将微生物接到适于它生长繁殖的人工培养基上或活的生物体内的过程。微生物接种技术是进行微生物实验和相关研究的基本操作技能。无菌技术：指在微生物实验工作中，控制或防止各类微生物的污染及其干扰的一系列操作方法和有关措施。无菌操作是微生物接种技术的关键。无菌操作主要目的：（1）保证实验操作中不被环境中微生物污染；（2）防止微生物在操作中污染环境或感染操作人员。微生物接种流程一、实验材料的准备工作（1）培养基的配制和相关器具的准备（2）灭菌和消毒二、无菌操作（1）接种前的准备工作（2）接种一、实验材料的准备工作（1）培养基的配制和相关器具的准备1、培养基的配置2、接种工具的准备：常用的接种工具有接种环、接种针和涂布棒。其中最常用的接种工具或移植工具是接种环。3、其他器具的准备（2）灭菌和消毒消毒：用较温和的物理或化学方法杀死物体上绝大多数微生物的措施，实际上是部分灭菌。例如，酒精擦拭。灭菌：采用强烈的理化因素使任何物体内外所有微生物永远丧失其生长繁殖能力的措施。灭菌干热灭菌湿热灭菌过滤除菌紫外线杀菌化学药剂杀菌其中高压蒸汽灭菌是微生物学研究和教学中应用最广泛、效果最好的湿热灭菌方法。灭菌原理：将待灭菌的物体放置在盛有适量水的高压蒸汽灭菌锅内。把锅内的水加热煮沸，并把其中原有的冷空气彻底驱尽后将锅密闭。再继续加热就会使锅内的蒸汽压逐渐上升，从而温度也随之上升到100℃以上。为达到良好的灭菌效果，一般要求温度应达到121℃（压力为0.1MPa）时间维持15到30分钟。也可以采用在较低的温度（115℃，压力为0.075MPa）下维持35分钟的方法。注意事项：①堆放灭菌物品时，严禁堵塞安全阀和放气阀的出气孔，必须留出空位保证其空气畅通，否则安全阀和放气阀因出气堵塞不能工作，造成事故。②灭菌液体时，应将液体灌装在硬制的耐热玻璃瓶中，以不超过3/4体积为好，瓶口选用棉花纱塞，切勿使用未打孔的橡胶或软木塞。③灭菌液体结束时，不准立即释放蒸汽，必须待压力表指针回零位方可放余汽。④对不同类型、不同灭菌物要求的物品，切勿放在一起灭菌，以免造成损失。⑤灭菌终了时，若压力表指针已回复零位，而盖不易开启时，则可将放气阀摘子置于放气方汽。使外界空气进入灭菌器内，真空消除后，盖即可开启。⑥高压灭菌锅内冷空气的排除是否完全极为重要，高压灭菌锅内冷空气排除不干净，将达不到灭菌所需的温度。二、无菌操作（1）接种前的准备工作1、仪器①超净工作台超净工作台是能将工作区已被污染的空气通过专门的过滤通道人为地控制排放，为实验室工作提供无菌操作环境的设施，以保护实验免受外部环境的影响，同时为外部环境提供某些程度的保护以防污染，是一种安全的微生物专用洁净工作台。原理：超净工作台的洁净环境是在特定的空间内，通过风机将空气吸入预过滤器，经由静压箱进入高效过滤器过滤，将过滤后的空气以垂直或水平气流的状态送出，洁净空气(进滤空气)按设定的方向流动而形成的。使操作区域达到所需的洁净度。超净工作台的使用及注意事项①使用前30到60分钟用75%的酒精或0.5%过氧乙酸喷洒擦拭消毒工作台面，打开紫外灯照射30min；②使用前10分钟将风机启动，调整风量，工作时关闭杀菌灯；③使用中，有机玻璃罩受到污染，严禁用酒精棉球擦拭，请用含水棉布檫拭；④请保持超净台整洁、干燥，不要堆积杂物，禁止存放无关的物品，以保持工作区的洁净气流不受干扰；⑤禁止在工作台面上记录书写，工作时应尽量避免作明显干扰气流的动作；⑥禁止在预过滤器进风口部位放置物品，以免挡住进风口造成进风量减少，降低净化能力；⑦使用完毕后，用消毒液擦拭工作台面，关闭送风机，重新开启紫外灯照射15min，最后关闭电源；②生物安全柜生物安全柜是为操作原代培养物、菌毒株以及诊断性标本等具有感染性的实验材料时，用来保护操作者本人、实验室环境以及实验材料，使其避免暴露于上述操作过程中可能产生的感染性气溶胶和溅出物而设计的。生物安全柜使用规程①操作前应将本次操作所需的全部物品移入安全柜，避免双臂频繁穿过气幕破坏气流；并且在移入前用70%酒精擦拭表面消毒，以去除污染。②打开风机5～10分钟，待柜内空气净化并气流稳定后再进行实验操作。将双臂缓缓伸入安全柜内，至少静止1分钟，使柜内气流稳定后再进行操作。③安全柜内不放与本次实验无关的物品。柜内物品摆放应做到清洁区、半污染区与污染区基本分开，操作过程中物品取用方便，且三区之间无交叉。物品应尽量靠后放置，但不得挡住气道口，以免干扰气流正常流动。④操作时应按照从清洁区到污染区进行，以避免交叉污染。为防可能溅出的液滴，可在台面上铺一用消毒剂浸泡过的毛巾或纱布，但不能覆盖住安全柜格栅。⑤柜内操作期间，严禁使用酒精灯等明火，以避免产生的热量产生气流，干扰柜内气流稳定；且明火可能损坏HEPA滤器。⑥工作时尽量减少身后人员走动以及开关房门，以防止安全柜内气流不稳定。⑦在实验操作时，不可打开玻璃视窗，应保证操作者脸部在工作窗口之上。在柜内操作时动作应轻柔、舒缓，防止影响柜内气流。⑧柜内使用的物品应在消毒后再取出，以防止将病原微生物带出而污染环境。⑨工作完全后，关闭玻璃窗，保持风机继续运转10～15分钟，同时打开紫外灯，照射30分钟。⑩安全柜应定期进行清洁消毒，柜内台面污染物可在工作完成且紫外灯消毒后用2%的84消毒液擦拭。柜体外表面则应每天用1%的84消毒液擦拭。超净工作台（cleanbench）与生物安全柜（BiosafetyCabinet）不同。超净工作台只能保护在工作台内操作的试剂等不受污染，并不保护工作人员，而生物安全柜是负压系统，能有效保护工作人员。2、无菌室的操作规则①将所有的实验器材和用品一次性全部放入无菌室（如同时放入培养基则需用牛皮纸遮盖）。应尽量避免在操作过程中进出无菌室或传递物品。操作前先打开紫外灯照射半个小时，关闭紫外灯后，在开始工作。②进入缓冲间后，应换好工作服、鞋、帽、戴上口罩，将手用消毒液清洗后，在进入工作间。③操作时，严格按照无菌操作法进行操作，废物应丢入废物桶内。④工作后应将台面收拾干净，取出培养物品及废物桶，用消毒液清洁，再打开紫外灯照射半个小时。3、无菌操作要求①在操作中不应有大幅度或快速的动作；②使用玻璃器皿应轻取轻放；③在火焰上方操作；④接种用具在使用前、后都必须灼烧灭菌；⑤在接种培养物时，协作应轻、准；⑥不能用嘴直接吸吹吸管；⑦带有菌液的吸管、玻片等器材应及时置于盛有5%来苏尔溶液的消毒桶内消毒；⑧操作时禁止再培养物上方移动手臂；（2）接种1、接种的一般流程接种工具灭菌接种工具冷却沾取标本接种接种工具灭菌防止污染标本防止污染环境2、到平板3、斜面接种技术斜面接种是从已生长好的菌种斜面上挑取少量菌种移植至另一新鲜斜面培养基上的接种方法。用于好气性微生物的接种。具体操作：①贴标签：接种前在试管上贴上标签，注明菌名、接种日期、接种人姓名等，贴在距试管口约2到3厘米处，也可使用记号笔标记。②点燃酒精灯。③接种：1）手持试管将菌种管和待接斜面的两支试管用大姆指和其他四指握在左手中，使中指位于两试管之间部位。斜面面向操作者，并使它们位于水平位置。②旋松管塞先用右手松动试管塞，以便接种时拔出③接种环灼烧灭菌右手拿接种环，在火焰上将环端灼烧灭菌，然后将有可能伸入试管的其余部分均灼烧灭菌，重复此操作，再灼烧一次④拔管塞用右手的无名指、小指和手掌边先后取下菌种试管和待接试管的试管塞，然后让试管口缓缓过火灭菌(切勿烧得过烫)⑤取菌待接种环冷却后，轻沾取少量菌体或胞子，然后将接种环移出菌种试管，注意不要使接种环碰到管壁，取出后带菌接种环不可通过火焰。⑥接种在火焰旁迅速将沾有菌种的接种环伸入另一支待接斜面试管。从斜面培养基底部向上作“Z”形来回密集划线，勿划破培养基。有时也可用接种针仅在斜面培养基的中央拉一条直线作斜面接种，直线接种可观察不同菌种的生长特点。⑦塞管塞取出接种环，灼烧试管口，并在火焰旁将试管塞旋上。⑧将接种环灼烧灭菌。斜面接种示意图4、液体接种具体操作：与斜面接种基本一致，只是在将接种环送入液体培养基时使环在液体与管壁接触的地方轻轻磨擦，使菌体分散，塞上试管塞再轻轻摇匀。如果菌种是培养在液体培养基中时，一般用移液管或滴管接种。5、划线接种目的：使混合的细菌呈单个分散生长，形成单个菌落，以便获得纯菌、活菌计数。方法：①分区划线法：适用于含菌量较多的标本②连续划线法：适用于含菌量较少的标本分区划线法连续划线法6、穿刺接种穿刺接种技术是一种用接种针从菌种斜面上挑取少量菌体并把它穿刺到固体或半固体的深层培养基中的接种方法。用于厌气性细菌培养、检查细菌的运动能力、保藏菌种。只适宜于细菌和酵母的接种培养具体操作：①贴标签②点燃酒精灯③接种1）手持试管2）旋松试管塞3）接种针灼烧灭菌，接着把在穿刺中可能伸入试管的其他部位也灼烧灭菌4）拔出试管塞5）取菌：用冷却接种针的针尖沾取少量菌种6）穿刺：将接种针自培养基中心平稳、快速垂直刺入培养基中，并且要将接种针穿刺到接近试管底部，然后沿着接种线拔出7）塞上试管塞8）接种针灼烧灭菌