液相色谱仪基本操作培训

液相色谱仪基本操作培训一、HPLC常规分析操作步骤及规程1）严格过滤色谱纯流动相，根据需要选择不同的滤膜2）对抽滤后的流动性进行超声脱气20-30min3）首先进行液相色谱仪使用登记，更换需要使用的色谱柱。4）打开仪器泵系统的电源开关，仪器启动自检完成后，打开色谱工作站，进行参数设置。5）松开排气旋钮，进行排气处理。6）调节流速，初次使用新的流动相，可以需要先关注压力，根据压力的情况调节合适的流速7）基线稳定后即可进样分析，分析样品时对样品的前处理非常重要8）分分析实验结束后，先关检测器氘灯，根据流动相的成分和所分析样品的溶解性，用相应的冲洗液冲洗液路。如果流动相成分中含盐，必须用含甲醇10％左右的甲醇水溶液充分冲洗系统（冲洗时间不少于40分钟），再用相应的色谱柱保护液（反相色谱柱用乙腈或甲醇，正相色谱柱用正己烷或正庚烷）冲洗色谱柱约20-30分钟9）冲洗完毕后，停止泵系统，关闭电源。卸下色谱柱，封口保存10）检查系统处于停止状态，电源断开后方可离开。二、使用注意事项：1、液路系统1）试剂首先必须是色谱级的2）脱气：由于流动相中含有微量的空气，经泵的压力左右，会在流通池里产生气泡，这对分析产生一定的影响，如噪音增大，甚至于掩盖信号峰，因此，流动相在使用前必须经超声脱气20min以上3）过滤：由于流动相里面有微小的颗粒杂质，如不经过过滤，会使单向阀堵塞，从而产生压力波动。同时样品溶液注入液相色谱仪之前也要采用0.45um的滤膜过滤，这一点很多操作人员不太注意，等到产生压力波动又不知道什么原因产生的。4）在线过滤器必须埋于液面以下。5）液路中的软管保持平整，避免受挤压。6）泵运行过程中，不可进行液路的连接和拆卸。7）泵运行中的系统压力一般不可超过250kg。如果压力过高，会引起进样阀泄露，严重时会引起泵的毁坏。8）进行液路的连接和拆卸（排气、更换色谱柱、液路管等）时，必须先停泵，等压力降至10附近才可进行更换。9）泵的关闭：仪器断开电源前，必须先停泵，等压力降至10左右才能关闭电源开关。10）泵系统的停置：如果仪器使用了水性缓冲剂（尤其是腐蚀性强的卤化物盐类）时，泵停置前应用大量的水性溶剂冲洗，然后用有机溶剂冲洗。否则腐蚀盐在系统内保持不动，会严重的减少不锈钢元件的寿命。11）系统所有管路、连接部件、密封部件及泵头，在更换之后都必须按一定程序进行清洗（丙酮---无水乙醇---二次蒸馏水顺次冲洗）后再用氮气吹干。12）泵头单向阀的清洗：长期使用过程中单向阀容易被污染，将单向阀取下，放入丙酮或异丙醇中超声处理半小时即可，超声时要让单向阀保持竖直状态。13）泵头的清洗：位于泵头后部的两根四氟液路管为清洗管，若流动相中含有盐的比例较大时，必须对液路进行清洗，清洗步骤如下：将一根清洗管放入到过滤过的蒸馏水中，蒸馏水瓶放置在高处；用针管吸另一根清洗管当有水滴出时将其放在一空瓶中，空瓶放在低处，在实验过程中一直对泵头进行清洗直到实验结束。泵头每月要定期冲洗一次，时间为1小时。14）若泵运行时压力突然上升，说明液路有堵塞的地方，检验方法遵循从后往前的原则，逐段拆下后，若压力下降说明此段堵塞，更换或冲洗即可。15）泵工作时要注意流动相不要被用完，设置警戒停泵溶剂量，否则空泵运转会加快磨损柱塞杆和密封圈。输液泵的压力不要太高，否则会使密封圈变形，降低密封圈使用寿命2、色谱柱1）连接时注意流向的正确性2）新柱在使用前必须仔细阅读使用说明书后，按说明书的要求使用。3）色谱柱长时间保存时，需用相应的色谱柱保护液进行保护，正相色谱柱一般保存于纯正己烷中，反相色谱柱一般保存于纯甲醇或乙腈中，柱接头要拧紧，仿制保护液挥发失去保护的作用。4）连接色谱柱及其他不锈钢管时，需细心，各个接头需配套，不可用力过猛。否则会出现系统漏液或色谱柱柱效降低的情况。5）流经反相色谱柱的流动相发生改变时，不可从有机溶剂直接全部变为水，反之亦然。6）若冲洗色谱柱时间较长，注意流动相的体积和流速的大小，以及废液瓶的装量情况。7）色谱柱应避免压力和温度的急剧变化以及机械震动。在进样的时候，进样阀扳手不能转动太慢，更不能停留在中间，如停留在中间，泵内压力剧增，这时再转动到进样位置时，过高的压力会损坏色谱柱。如出现机械震动（掉在地上）则会改变填料的充填状态。8）以硅胶为载体的键合固定相的使用温度通常不超过40℃，为了改善分离度可适当提高色谱柱的使用温度，但不能高于60℃。9）流动相的pH值大于8时，可使载体硅胶溶解，当pH值小于2时，与硅胶相连的化学键合相易水解脱落。因此选择色谱柱时应注意，当色谱系统中需要使用pH值大于8的流动相时，应选用耐碱性的填充剂，当色谱系统中需要使用pH值小于2的流动相时，应选用耐酸性的填充剂。现在的色谱柱商品有很多种，也开发了很多耐酸碱的色谱柱，选择时应注意其使用的范围。10）色谱柱的再生因为色谱柱是消耗品，随着使用时间或进样次数的增加，会出现色谱峰高降低，峰宽加大或出现肩峰的现象，一般来说可能是柱效下降。（1）、反相柱的再生：依次采用20-30倍的色谱柱体积的用甲醇冲洗，用二氯甲烷冲洗，再用甲醇冲洗。（2）、正相柱的再生：依次以20-30倍色谱柱的体积的正己烷、异丙醇、二氯甲烷、甲醇作为流动相冲洗色谱柱。3、检测器1）检测器的氘灯有使用寿命，平衡色谱柱或冲洗液路时可关闭氘灯。2）氘灯关闭后再次开启中间的间隔时间至少为5分钟。3）检测器的流通池在分析过程中容易被污染而导致基线无法平衡时，需要对检测器进行清洗，一般先采用水－甲醇（约90﹕10）冲洗30分钟，然后用流速为2ml/min的30％的硝酸冲洗30分钟，然后用纯水冲洗直到流出的水溶液显中性，然后在用纯甲醇冲洗2分钟即可。三、HPLC系统日常维护保养操作程序（适用于所有液相色谱仪）1、HPLC的日常操作环境条件：温度：10—30℃；相对湿度80％；应远离高电干扰、高振动设备。仪器应避免强酸、强碱的腐蚀，避免流动相及其他异物进入仪器内部。2、流动相处理2.1流动相均需色谱纯度，水用去离子水。脱气后的流动相要小心振动尽量不引起气泡。2.2流动相使用前需用0.45um的适当滤膜进行过滤。2.3对抽滤后的流动相进行超声脱气5分钟。如果流动相由缓冲液和色谱纯有机溶剂混合组成，应先将缓冲液过滤，按比例将缓冲液和有机溶剂混匀后再超声脱气。2.4所有过柱子的液体均需严格的过滤。2.5正常情况下，样品测试前仪器首先用不含盐的流动相或（50％甲醇或50％乙睛）冲洗10-20分钟，然后再进入测试用流动相【如流动相为缓冲试剂，则先要用90%水（10%流动相相应的有机相）冲洗10-20分钟，直至色谱柱中有机相冲净为止】。2.6每次在使用流动相时，必须先观察流动相内是否有异物及浑浊，如有则不能使用。2.7配好的流动相应贴好标签，并做好相应的配制记录，过期的流动相不能使用，对于含有缓冲盐的流动相一般应新鲜配制使用，如果确实需要贮存，可在冰箱内冷藏，并在3天内使用，使用前必须过滤。2.8避免使用金属腐蚀性溶剂。2.9避免使用腐蚀石英及损坏检测池光学特性的碱性溶剂。2.10应根据流动相的使用情况，配制相应量的流动相，避免浪费。2.11储存流动相的瓶子随时保持加盖状态，防止灰尘掉入和有机溶剂挥发，保护实验人员身体健康。3、泵的维护保养：3.1使用流动相尽量要清洁；3.2进液处的砂芯过滤头每月应定期清洗：先用洗液浸泡，再用水超声清洗2-3次，再用水煮2-3次，最后用甲醇浸泡处理。3.3流动相交换时要防止沉淀；流动相交换时应逐步过渡到要换的流动相，特别是交换后易产生沉淀的流动相。3.4避免泵内堵塞或有气泡；每次使用时做排气泡处理。排气时，旋开清洗阀11/2圈左右，用4mL/min流速排气泡，旋紧时不得过紧。3.5泵壳体必须保持清洁，清洁时用一柔软的擦布沾上少许水或中性去污剂的水溶液轻轻擦拭，不要用过分湿润的擦布，以免液体流进泵内。3.6当压力不稳定波动，运行渗漏测试证实后，需要更换球形输出阀。3.7通过过滤芯的压力大于10bar时，提示过滤芯有污染物或阻塞现象，用纯甲醇浸泡过滤芯并于超声波清洗器进行清洗，如清洗后仍不能正常工作应提出申请更换过滤芯。3.8泵头低的一端出现渗漏，说明泵密封圈破损，需要更换密封圈。3.9在仪器正常运行过程中，不得使泵在没有流动相的情况下空运行。3.10带Sealwash的设备，在使用有盐流动相时应开Sealwash，用10％异丙醇水溶液冲洗，冲洗速度为每分钟2～3滴。注意冲洗溶液应每周更换一次。3.11岛津仪器使用含盐流动相后，应用纯化水冲洗泵壳。4、进样器的维护保养：4.1每次分析结束后，要反复冲洗进样口及进样针，防止样品的交叉污染；4.2进样针要使用专用的配套进样针，使用前后均要处理干净，避免污染；不得使用气相色谱仪的尖头进样针。4.3手动进样器不使用时，将带注射器的进样针插上或套上注射器帽，避免灰尘或异物进入。4.4所有样品进样前必须经过过滤，不得将未溶解异物或样品注入进样器。4.5若使用自动进样器，在取样机械臂活动范围内不应有任何的管线或其他阻挡取样的物品出现。4.6自动进样器六通阀上的进出口管线未经许可不得随意拆卸。4.7样品检测完后，应清洗自动进样器进样针。5、色谱柱的保养：5.1柱子在任何情况下不能碰撞、弯曲或强烈震动。5.2当柱子和色谱仪联结时，阀件或管路一定要清洗干净；联结时松紧程度要适当，避免漏液及过紧损坏联结处，特别是不同类型仪器间色谱柱的连接。5.3要注意流动相的脱气，避免使用高粘度的溶剂作为流动相。5.4压力不能太大，最好不要超过200Bar。5.5进样样品要提纯；严格控制进样量。5.6每天分析工作结束后，要清洗进样阀中残留的样品。5.7每天分析测定结束后，都要用适当的溶剂来清洗柱，不得使用纯水冲洗色谱柱；如使用了含盐的流动相，应先用10％不含盐的有机相（有机相为流动相中所含有的有机相）溶液冲洗柱20分钟，然后用不含盐的流动相或50％甲醇（或乙睛）冲洗柱30分钟，再用甲醇或乙睛冲洗柱子20分钟。5.8若分析柱长期不使用，反向色谱柱应用100％甲醇保存并两端封闭严实，平放于规定的地方。严禁色谱柱未经冲洗就存放。5.9应注意色谱柱的适用范围，如pH值等，以及流动相在色谱柱中的流动方向。6、检测器的维护保养：6.1紫外灯的保养：在分析前、柱平衡得差不多时，方可打开检测器；在分析完成后，马上关闭检测器。6.2启用新的紫外灯时，应将灯的使用时间清零。使用时应观察紫外灯的使用时间，当紫外灯达到使用寿命时及时更换。6.3检测器不得频繁开关电源。6.4检测器应保持清洁，平时可用软布蘸取少许水或温和洗涤剂的水溶液进行清洗。清洗布不要过分润湿以防止液体流入检测器内。6.5在检测过程中如发现噪声或漂移超过规定的应用限制或灯不亮时说明紫外灯出现了故障或已经达到了紫外灯的使用期限，应申请更换氘灯，更换后应进行VWD测试。6.6如出现渗漏或由于污染使流通池窗口的强度降低,流通池出现背景较高，应用相同的有机溶剂如纯甲醇低流速长时间冲洗流通池，如仍不能正常工作通知设备员，上报设备部申请维修或更换流通池。更换完毕后应做密封测试。6.7DAD检测器维护：在使用DAD检测器时，如果不要求进行波长扫描或峰纯度检测，应将spectral项下的store选择None，不得选择其他值。进行波长扫描或峰纯度检测时选择All。7、色谱工作站的维护7.1方法设定按液相色谱标准操作规范（SOP）进行，其它参数不得随意更改。7.2数据文件不得覆盖、修改、删除，各品种检测数据应按规定存放于相应目录下，不得擅自创建、修改或变动目录。7.3未经培训合格的人员不得使用色谱工作站及色谱仪。8、系统维护8.1严格按照操作规程进行操作；系统不得随意拆卸，如发生故障及时报告主管做出妥善处理，并如实在使用记录上填写好“检验仪器故障及异常情况登记记录”，不得擅自进行处理。8.2关机时，先关色谱工作站，再关液相色谱仪。8.3如实填写好仪器使用登记。8.4仪器使用人员应对仪器的正常运行负责，在使用仪器前及仪器使用过程中应确定仪器状态，确保在仪器正常状态下进行