长链非编码RNA的常用研究技术和方法-王卉张玲玲王冰蕊任思蕊高洁佟静媛刘金花

中国细胞生物学学报ChineseJournalofCellBiology2016,38(8):DOI:10.11844/cjcb.2016.08.0019x_±s收稿日期:2016-01-13接受日期:2016-05-06国家自然科学基金(批准号:31471291)资助的课题*通讯作者。Tel:[phone],E-mail:[e-mail];Tel:[phone],E-mail:[e-mail]:January13,2016Accepted:May6,2016ThisworkwassupportedbytheNationalNaturalScienceFoundationofChina(GrantNo.31471291)*Correspondingauthors.Tel:[phone],E-mail:[e-mail];Tel:[phone],E-mail:[e-mail]长链非编码RNA的常用研究技术和方法王卉张玲玲王冰蕊任思蕊高洁佟静媛刘金花*石莉红*(中国医学科学院、北京协和医学院血液学研究所、血液病医院,实验血液学国家重点实验室,天津300020)摘要长链非编码RNA(longnoncodingRNA,lncRNA)在胚胎发育、谱系分化、基因印迹、疾病发生等过程中都发挥着非常重要的调控作用,是转录调控的重要分支及热点。随着转录组学高通量测序技术的日臻完善,越来越多的lncRNA被发现。为了全面解析lncRNA的作用及调控机制,该综述从lncRNA的发现、表达、细胞定位、结构、功能、机制研究等不同方面总结了当前常用的研究技术、方法及它们的最新进展,为其深入研究提供基础和线索。关键词lncRNA;高通量转录组测序技术;CRISPR/Cas9技术;ChIRP;染色体构象捕获技术;lncRNA数据库TheMini-reviewofTechniquesandMethodsUsedforLongNon-codingRNAStudiesWangHui,ZhangLingling,WangBingrui,RenSirui,GaoJie,TongJingyuan,LiuJinhua*,ShiLihong*(StateKeyLaboratoryofExperimentalHematology,InstituteofHematology,BloodDiseaseHospital,ChineseAcademyofMedicalSciences&PekingUnionMedicalCollege,Tianjin300020,China)AbstractLongnoncodingRNAs(lncRNAs),anovelclassofnon-codingRNAmoleculeslongerthan200nucleotides,areidentifiedlargelyduetotherapiddevelopmentofthenextgenerationRNAsequencingtechnology.RecentstudiesrevealthatlncRNAsplayessentialrolesinabroadrangeofbiologicalprocesses,includingtheembryonicdevelopment,lineagedifferentiation,genomicimprintinganddiseasepathology,etc.GiventhenecessaryfunctionsoflncRNAs,itisimportanttosummarythetechniquesandmethodscurrentlyusedforlncRNAsstudies,whichwillshedmorelightonfuturelncRNAsstudies.Therefore,inthisstudywereviewthefrequently-usedmothodsfortheidentification,expression,function,aswellastheregulatorymechanismoflncRNAs,andupdatetheirmostrecentdevelopment.KeywordslncRNA;RNA-Seq;CRISPR/Cas9;ChIRP;chromosomeconformationcapture;lncRNAdatabases人类基因组中仅2%的转录子可以编码蛋白质,但至少80%的基因组可以被转录[1]。在这些非编码蛋白质的转录子中,绝大部分属于长链非编码RNA(longnon-codingRNA,lncRNA),即长度超过200bp,开放阅读框(openreadingframe,ORF)小于300bp的转录子。研究表明,lncRNAs在胚胎发育、谱系分化、基因印迹、疾病发生等过程中都发挥着非常重要的调控作用,是转录调控网络的关键组成部分[2-5]。随着对lncRNA生物功能认识的不断深入,它的研究也逐渐成为生命科学领域转录调控的重要分支和热点。为了更加系统地认识lncRNA在正常组织发育分化以及异常病变中的作用,我们总结了当前研究lncRNA的一些常用方法,为lncRNA的深入研究提供参考。2016-08-1011:08:56·综述·1LncRNA的发现与鉴定1.1LncRNA的发现LncRNAs的发现主要依赖于转录组学高通量测序技术。现有的测序技术有微阵列技术(microarrays)、第二代高通量转录组测序技术(second-generationRNA-sequencingtechnology,RNA-Seq)、单细胞测序技术(single-cellsequencing)、单分子测序技术(singlemoleculesequencing,SMS)、RNA捕获测序技术(RNAcapture-Seq)等。我们在此着重介绍发现lncRNAs的三个主流技术:RNA-Seq、单细胞测序技术以及单分子测序技术(singlemoleculesequencing,SMS)。1.1.1利用RNA-Seq发现lncRNARNA-Seq是当前转录组测序的主流技术。它不需要预制探针,而是将测序文库(单链cDNA)连接到测序载体上,在合成互补链时通过捕捉不同核苷酸的荧光信号来得到测序结果。该技术能检测任何物种转录组的表达,具有实验成本低、背景信号低、转录子表达丰度测量准确、重复性好等优点。在lncRNA研究中,绝大多数lncRNA的发现都得益于该技术[3,6]。不过,RNA-seq技术对高丰度转录本有一定的偏好性,而由于lncRNA的表达水平普遍偏低,利用它来建立lncRNA的表达谱时需要适当增加测序深度[7]。1.1.2利用单细胞测序技术发现lncRNARNA-Seq技术对待检测样本量有一定的要求,无法针对少量、珍贵样本进行转录组测序。单细胞测序可将检测样本量降至单细胞,对其深度测序可获得这些少量、珍贵样本的转录表达谱(其中,包括lncRNA),同时该技术还适用于研究异质性细胞群体中单细胞lncRNA的表达谱。Kim等[8]首次将该技术用于lncRNA的研究,发现在诱导体细胞重编程为多能干细胞(inducedpluripotentstemcell,iPSC)过程中lncRNA表达呈动态变化,重编程过程中被激活的lncRNA能够抑制谱系分化特异基因表达,促使细胞获得全能性,提示lncRNA在细胞命运转换中起重要作用。该研究首次证明了利用单细胞测序技术研究lncRNA的可行性,为将来在组织干细胞、肿瘤干细胞等单细胞水平研究lncRNA提供了参考。不过,该技术也有局限性,例如测序结果受RNA逆转录酶的效率、PCR扩增误差等的影响[9-10],解读测序结果时需要考虑这些因素。1.1.3单分子测序技术有望更加准确地检测lncRNA的表达在上述测序技术的基础上提出了第三代测序技术(third-generationsequencing,TGS),即单分子测序技术,它代表了测序技术的未来。SMS在测序过程中,不需要PCR富集扩增,而是直接将DNA或者cDNA固定在芯片上,在其互补链合成过程中利用不同荧光标记的dNTP进行测序[11]。该技术避免了PCR扩增带来的系统偏差,但是仍面临荧光信号弱,精确捕获难,测序结果错误率较高等问题,尚处于开发阶段,还没有应用于lncRNA的研究。在不久的将来,随着灵敏度更高的信号识别系统的开发,该技术将更加成熟完善[12],届时将为lncRNA研究提供更加全面准确的信息。1.2LncRNA的鉴定1.2.1鉴定转录子蛋白质编码潜能鉴定转录子蛋白质编码潜能的方法有软件预测和实验鉴定两种[13]。目前预测转录本编码能力的常用软件有BLASTX[14]、CPAT[15]、PhyloCSF[16]、CPC[17]、CNCI[18]等(表1)。Luo等[19]使用CPAT软件分析造血干细胞(hematopoieticstemcells,HSCs)中新发现转录子的编码潜能,建立了HSC中lncRNA的表达谱,并首次研究发现,lncRNAlncHSC-1和lncHSC-2调控HSCs的自我更新和分化。由于软件各自的局限性,联合使用多个软件可以更加全面地对转录子的编码潜能进行预测。例如,Wang等[20]首先利用PhyloCSF软件预测转录本的编码潜力,随后结合BLASTX软件从同源序列保守方面进一步筛查,最终发现了1000多个大鼠组织中特异表达的lncRNA。然而,这些常用软件需要对核苷酸进行序列比对,运行时间较长,并且受已有数据的限制。为了解决以上难题,新开发的软件在算法上进行了改进,引入了更多的参数(例如转录子结构、表达水平等)并加快了运行速度(PLEK)[21],从而能快速准确地预测转录子的编码潜能。除软件外,还可以通过实验手段鉴定lncRNA的编码潜能。LncRNA大部分位于细胞核内,分布于细胞质内的lncRNA可结合在核糖体上或自由分布于细胞质中。通过核糖体图谱(ribosomeprofilingassayorRibo-seq)能检测转录子是否结合在核糖体上,从而初步判断其是否具有蛋白质编码潜能。但是,转录子即使结合在核糖体上,也并不代表有蛋白质编码能力,它们很可能是利用核糖体进行迁移。研究发现,在翻译过程中核糖体遇到mRNA终止子王卉等:长链非编码RNA的常用研究技术和方法3(stopcodon)时将使mRNA快速脱离,而随着迁移的ncRNA则不然。所以结合核糖体图谱和转录子在终止子位置从核糖体上脱离的速度(ribosomereleasescore,RRS)可以鉴别ncRNA[22]。核糖体图谱适用于在组学水平检测转录子的编码潜能,而针对特定的转录子,可以利用末端标记法(terminaltagassay)来甄别其编码潜能,例如lncDC[23]鉴定。1.2.2鉴定lncRNA的表达Northernblot和实时荧光定量PCR(RT-qPCR)是当前实验检测lncRNA表达的主流技术。Northernblot是基于碱基互补配对原理针对目标基因设计带有放射标记的探针,探针与目的片段杂交放射显影后检测lncRNA的表达。该技术的优点在于能准确检测lncRNA表达丰度及转录子长度,但是由于探针需要进行放射性标记,有潜在的安全隐患以及放射污染问题。RT-qPCR是将RNA逆转录为cDNA,在PCR扩增过程中利用体系中的荧光信号实时定量监测cDNA含量的变化。RT-qPCR检测相对快捷、方便,已经逐渐成为检测lncRNA表达的主流技术。但是需要注意RT-qPCR的结果依赖于逆转录酶的稳定性,此外RT