土壤沉积物和固体废物二恶英类的筛查酶联免疫法重庆市

IICS13.030Z70备案号：33235-2012DB50重庆市地方标准DB50/T427—2012土壤、沉积物和固体废物二恶英类的筛查酶联免疫法Soil,SedimentandSolidWasteScreeningofpolychlorinateddibenzo-p-dioxins(PCDDs)andpolychlorinateddibenzofurans(PCDFs)Enzyme-LinkedImmunoassay2012-02-15发布2012-09-01实施重庆市环境保护局重庆市质量技术监督局发布II目次前言.....................................................................III1范围......................................................................12规范性引用文件............................................................13术语和定义、符号和缩略词..................................................14方法原理..................................................................25试剂和材料................................................................26仪器设备..................................................................37样品采集..................................................................38样品前处理................................................................39酶联免疫分析..............................................................510标准曲线绘制.............................................................612检测限、精密度和准确度...................................................713质量保证和质量控制.......................................................814报告.....................................................................815废物处理.................................................................916注意事项.................................................................9附录A（规范性附录）二恶英类分析流程图...................................10附录B（资料性附录）样品蒸发模式..........................................11附录C（资料性附录）标准溶液浓度序列......................................12附录D（资料性附录）标准曲线控制参数......................................13III前言本标准根据GB/T1.1-2009规定进行编制。本标准为推荐性标准。本标准为首次发布。本标准由重庆市环境保护局提出并归口。本标准起草单位：重庆市固体废物管理中心。本标准起草人：廖世国阳剑蔡洪英季祥海郑鸿柯本标准自2012年9月1日实施。1土壤、沉积物和固体废物二恶英类的筛查酶联免疫法1范围本标准规定了采用酶联免疫法筛查土壤、沉积物和固体废物（包含飞灰、盐泥、工业废渣、污泥）中的多氯代二苯并二恶英（PCDDs）和多氯代二苯并呋喃（PCDFs）方法。本标准适用于土壤、沉积物和固体废物中二恶英类的筛查，利用酶联免疫法筛查土壤、沉积物和固体废物中的多氯代二苯并二恶英和多氯代二苯并呋喃。2规范性引用文件下列文件对本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。HJ/T20-1998《工业固体废物采样制样技术规范》HJ/T166-2004《土壤环境监测技术规范》HJ494-2009《水质采样技术指导》3术语和定义、符号和缩略词下列术语和定义适用于本标准。3.1术语和定义3.1.1二恶英类多氯代二苯并二恶英(PCDDs)和多氯代二苯并呋喃(PCDFs)的总称。3.1.2同类物二恶英类所有化合物互为同类物。二恶英类共有210种同类物。3.1.32,3,7,8-多氯代二恶英类指在2,3,7,8位均有氯原子取代的二恶英类同类物，共有17种，其中多氯代二苯并二恶英有7种，多氯代二苯并呋喃有10种。3.1.4毒性当量（TEQ）各二恶英类同类物浓度折算为相当于2,3,7,8-四氯代二苯并二恶英毒性的等价浓度，本标准检测结果为Bio-TEQ，经换算后可转换为I-TEQ。3.1.5孵育在20-26℃下，使二恶英类与酶联免疫测定管中的抗体充分结合的过程。3.1.6试剂空白以分析待测样品溶液所使用的溶剂作为空白，其余操作步骤和实际样品相同的空白实验。3.1.7操作空白除不添加实际样品外，样品制备、前处理、仪器分析和数据处理步骤与实际样品分析步骤相同的空白实验。3.2符号和缩略词23.2.1PCDDs多氯代二苯并二恶英，有75种同类物。3.2.2PCDFs多氯代二苯并呋喃，有135种同类物。3.2.32,3,7,8-TCDD2,3,7,8-四氯代二苯并二恶英。3.2.4HRP辣根过氧化物酶。3.2.5TEG四乙烯乙二醇。3.2.6DF1-60酶联免疫试剂盒本标准采用的一种试剂盒，包含酶联免疫测定管，样品稀释液，HRP，HRP底物，终止液（1mol/L盐酸溶液），TritonX-100，保留剂。3.2.7CAF校正因子。4方法原理酶联免疫法的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保持其免疫学活性，酶标记的抗原或抗体既保留其免疫学活性，又保留酶的活性。在测定时，受检样品（测定其中的抗体或抗原）与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与液体中的其他物质分开。再加入酶标记的抗原或抗体，也通过反应而结合在固相载体上。此时固相上的酶量与样品中受检物质的量呈一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与样品中受检物质的量直接相关，故可根据呈色的深浅进行定性或定量分析。参见图1和附录A“二恶英分析流程图”。蓝色产物PCDD/FHRP(辣根过氧化物酶)HRP底物干扰物抗二恶英抗体图1筛查原理简单示意图5试剂和材料除非另有说明，分析试剂均使用农残级试剂，并进行空白实验。有机溶剂浓缩万分之一倍，不得检出二恶英类。35.12,3,7,8-四氯代二苯并二恶英：标准品试剂5.2无水硫酸钠：分析纯5.3酸洗石英砂5.4正己烷5.5丙酮5.6甲苯5.7甲醇5.8正十四烷：分析纯5.9盐酸：优级纯。5.10二氯甲烷5.11SP3-60试剂盒（含40mL萃取瓶、碳柱、钢珠和酸性硅胶），SP2-ST试剂盒(含硅胶柱和空柱)，SP2-RT试剂盒（含活塞），DF1-60试剂盒5.1225mL容量瓶5.13连续移液器（100μL-2mL），微量移液器（0-10μL，0-100μL）。5.14带有聚四氟乙烯树脂内衬盖子的玻璃小瓶(2－12mL)。5.15玻璃试管（15-20mL）5.16铝箔5.17过滤筛（200目）6仪器设备6.1电子天平（百分之一）6.2平板轨道振荡器（可做椭圆旋转）6.3离心机6.4氮气吹干仪6.5旋转蒸发仪6.6索氏提取器6.7分光光度计（波长450nm）7样品采集土壤采集按HJ/T166-2004《土壤环境监测技术规范》中采样的规定方法实施。沉积物采集按HJ494-2009《水质采样技术指导》中采样的规定方法实施。固体废物采集按HJ/T20-1998《工业固体废物采样制样技术规范》中采样的规定方法实施。采集后的土壤、沉积物和固体样品在实验室中风干、磨碎、过筛，保存在棕色玻璃瓶中，贮存于2-6℃环境中。样品采集后，40天内应完成提取。8样品前处理8.1土壤和沉积物样品8.1.1所有与实验相关的玻璃器皿，都要预先用甲苯清洗，干燥。空白值偏高时，可考虑使用马弗炉4对所有仪器进行烘干,降低空白值。8.1.2样品实验前应进行风干、磨碎和过筛（200目过滤筛）处理。8.1.3样品混匀后称取5.00g加入到40mL萃取瓶（SP3-60试剂盒）中（每个瓶子写好标签）。8.1.4每个萃取瓶中加入5g酸洗石英砂、10-20g无水硫酸钠，再加入3颗钢珠(在此步添加2,3,7,8-TCDD于方法空白和样品中，通过筛查结果计算方法空白和样品的加标回收率)。8.1.5每个萃取瓶中加入20mL正己烷和丙酮混合溶液（体积比1：1），拧紧瓶盖，将萃取瓶放入平板轨道振荡器中进行椭圆震荡4小时，振动频率为180-200次/分。此步同时计算正己烷和丙酮混合溶液（体积比1：1）的密度。8.1.6震荡完毕后取出萃取瓶静置6-8小时，用吸量管将萃取瓶中上清液全部转移到已标记的玻璃试管中（玻璃试管事先称重），转移完成后对玻璃试管进行称重，记录所转移上清液的质量。再根据记录的上清液的质量计算所转移上清液的体积。8.1.7每个玻璃试管中加入0.25mL正十四烷，将每个玻璃试管置于氮气吹干仪中在40℃水温下进行氮吹，至丙酮溶液完全清除。8.1.8氮吹完毕后每个玻璃试管中加入5mL正己烷，若玻璃试管中溶液颜色较深则应加入1-2g酸性硅胶（SP3-60试剂盒）处理，待溶液澄清。8.1.9预洗柱：硅胶柱（SP2-ST）中加入10mL正己烷，正己烷从柱子底端滴下，从SP3-60试剂盒中取出碳柱，加入正己烷在碳柱的平口端，将其平口端接到硅胶柱的底端并拧紧，硅胶柱与碳柱连接处不允许气泡产生。同时硅胶柱中正己烷应覆盖硅胶（每根硅胶柱做好标记）。8.1.10预洗后的硅胶柱中加入8.1.8步骤中玻璃试管中溶液进行过柱，分2次每次用2mL正己烷润洗玻璃试管，润洗液全部加入已标记的硅胶柱中，以保证所有的溶液全部转入硅胶柱中，进行加压过柱，至溶液液面略高于硅胶上表面时停止加压。8.1.11分2次过柱，每次加入15mL正己烷到硅胶柱中过柱。第二次过柱时溶剂距离碳柱顶部1-2cm时停止加压（保持碳柱的湿润状态）。8.1.12从硅胶柱上取下碳柱，将其平口端连接到空柱（SP2-ST试剂盒）底部，加入6mL甲苯和正己烷混合溶液（1：1）到空柱中进行加压过柱，待溶液流至碳柱顶部时停止加压（保持碳柱湿润状态）（空柱做好标记）。8.1.13从空柱上取下碳柱，将其斜口端接到同一根空柱上，加入12mL甲苯加压过柱进行洗脱，洗脱液接收在玻璃试管中，甲苯完全流过碳柱，直至不再有液体滴下为止（玻璃试管作好标记）。8.1.14根据实验样品情况选择蒸发模式（见附录B），在玻璃试管中加入保留剂（DF1-60试剂盒）（以附录B中B模式为例，B模式下加入量为62.5μL），在70℃水温下进行氮吹，至甲苯全部清除。8.1.15氮吹完毕后取出试管，放置于离心机中在1500-2000转每分钟转速下离心5分钟，将所有样品溶液富集在试管底部。8.2固体废物样品8.2.1所有与实验相关的玻璃器皿，都要预先