地高辛标记探针的Southern-杂交

地高辛标记探针的Southern杂交1.探针标记(20µL体系)：1)将10ng-1µg模板DNA用无菌去离子水补足至16µl。2)沸水浴或干浴锅98oC10分钟，使DNA变性成单链并迅速冰浴冷却。3)充分混匀DIG-highPrimer（1#管），并取4µl至变性DNA管，混匀并离心；4)37oC温育1小时或过夜（最大到不超过20小时）；5)停止反应，加2µL0.2MEDTA（pH8.0）或65oC加热10分钟。若不用将于-20oC冰箱保存。2.探针标记效率检测：将地高辛标记好的探针作一系列的稀释，点到一条尼龙膜上，同时用地高辛标记的controlDNA作对照标准，120℃固定30分钟；然后用地高辛抗体免疫检测，按BNT/BCIP显色步骤显色；比较显色结果，选择带有可以接受的背景的最高探针浓度做正式的杂交。操作步骤如下：1)根据表1DIG-HighPrimeDNA标记及检测试剂盒理想条件下探针的标记产量将标记的探针稀释到1ng/μl，将试剂盒提供的controlDNA稀释到1ng/μl(原始浓度是5ng/μl)，然后按照表2作一系列的稀释探针及controlDNA稀释表1DIG-HighPrimeDNA标记及检测试剂盒理想条件下探针标记产量TemplateDNA1h20h10ng45ng600ng30ng130ng1050ng100ng270ng1500ng300ng450ng2000ng1000ng850ng2300ng3000ng1350ng2650ng表2探针DNA及ControlDNA系列表TubeDNA(µl)FromTube#DNAdilutionbuffer(μl)DilutionFinalconcentration1Dilutedorginal1ng/µl2211981:10010pg/µl3152351:3.33pg/µl452451:101pg/µl553451:100.3pg/µl654451:100.1pg/µl755451:100.03pg/µl856451:100.01pg/µl90-50-01)将上述稀释的2-9号管的controlDNA及探针DNA各取1μL点膜；2)120oC固定30min或紫外交链3-5min；3)将膜放入装有20mLMaleicacidbuffer的塑料器皿中，室温振荡2min；4)将膜放入10mLBlockingsolution中室温温育30min；5)将膜放入10mLAntibodysolution中室温温育30min；6)用10mLWashingbuffer洗2次，每次15min；7)在10mLDetectionbuffer平衡2-5min；8)将膜放入2mL新配制的Colorsubstratesolution(从试剂5#中取100ul到5mL)中暗室条件下显色。显色过程中不要摇动或振荡!9)当斑点或带显示出来后，用50ml灭菌的双蒸水洗膜5分钟，照相染色至0.1pg的ControlDNA出现斑点，比较标记的探针与ControlDNA染色情况计算出地高辛标记的DNA的量：如果0.1pg的探针及对照稀释点都显色，则探针标记理想；如果0.1pg的对照显色，0.1pg的标记探针没显色，但0.3pg显色，则计算探针浓度（约为理想浓度的1/3）以确定杂交时加多少探针（25ng探针/ml杂交液）；如果0.1pg的对照显色，但标记探针0.3pg的斑点没显色，则应重新标记探针。3.凝胶处理：1)在琼脂糖凝胶上电泳分离DNA。取出凝胶，切去边缘多于部分，在紫外灯下照相（放一标尺，可从像片中读出DNA迁移的距离）；2)将凝胶置于200mL变性液中，浸泡45分钟(分两次)，并温和地不断振荡，使凝胶上的ds-DNA转变为ss-DNA，然后用重蒸水冲洗凝胶几次；3)用中和液浸泡凝胶并不断地振荡45分钟(分两次)，将凝胶中和至中性，防止凝胶的碱性破坏硝酸纤维膜；4)取一个瓷盘，在底部放一块玻璃板，使盛器内的20倍SSC转移滤液低于玻板表面，在玻板表面盖4层滤纸，滤纸两边浸没于20倍SSC溶液中，在玻璃和滤纸之间，赶掉所有的气泡；5)取中和后的凝胶，点样孔向下地放在滤纸上，用玻璃棒滚动去除胶与滤纸之间的气泡；6)剪一块与胶大小一致的尼龙膜（带正电荷，比胶大2mm），放在无菌超蒸水表面，使之自然吸水下沉，将膜转入20×SSC中浸泡5min；7)将浸润的膜准确地盖在凝胶上面，膜与凝胶接触后，不再移动；8)将四张与膜大小相同的滤纸置于2×SSC溶液中浸润，盖在膜上，赶走气泡；9)滤纸上放一叠与吸水纸，吸水纸上放一块大小合宜的玻璃板，玻璃板上压0.5kg重物，水平放置，转移4~18h；10)取下吸水纸及滤纸，揭去胶，将尼龙膜于2×SSC中浸泡5min，再置于滤纸上吸干；11)用滤纸包好印迹膜，DNA面朝上，120oC烘烤30min或置于紫外交联仪中紫外照射2min，将DNA交联在尼龙膜上，4oC保存备用。注意，滤膜以下任何实验中都不应干燥！4.预杂交1)DIGEasyHyb：将64mL无菌去离子水分两部分倒入试剂7#瓶，37oC摇动溶解5分钟；2)计算杂交温度：通常为37oC-42oC，计算公式为：Tm=49.82+0.41(%G+C)-(600/I)(I=lengthofhybridinbasepairs)Topt.=Tm-20to25oCForsequencesthatare80%homologous,theThybwillbelowerthanthatcalculatedabove(approx.1.4°Clowerper1%mismatch).3)预热一定体积的DIGEasyHyb（10mL/100cm2膜）至杂交温度37-42oC；4)预杂交30分钟。在不加探针的情况下，仅将膜放在杂交液中下充分润湿；5)变性：DIG标记的探针（约25ng/ml）置98oC干浴锅中5min后迅速放在冰上冷却。5.杂交1)将变性的探针加入预热的DIGEasyHyb（3.5mL/100cm2）中，混匀，避免泡沫；2)倒出预杂交液，加入探针和DIGEasyHyb混合液；3)继续在杂交温度下杂交6h至过夜。注：含有探针的DIGEasyHyb杂交液可重复利用，杂交结束后用枪吸出放入1.5mL离心管中于-20oC保存，可重复使用几次，只需在使用前于68oC处理10min即可。6.洗膜1)用2×SSC，0.1%SDS在15-25oC冷洗2次，每次5~10min，洗涤过程中要轻轻摇动；2)用0.5×SSC，0.1%SDS在65-68oC杂交管中热洗2次，每次15min。Foraprobewiththefollowing...UsethefollowingHighStringencyHomologytoTargetGC-contentBufferTemperature80–100%Average(40%)0.5xSSC+0.1%SDS65°C,ifprobeis100bp80%Average(40%)0.5xSSC+0.1%SDSApprox.60°C*80–100%High(50%)0.1xSSC+0.1%SDS68°C*Exacttemperaturemustbedeterminedempirically.7.检测1)杂交和洗膜后，用Maleicacidbuffer浸泡1-5min；2)准备1×Blocksolution：用Maleicacidbuffer10×稀释试剂（6#10×Blockingsolution）成1×的工作液，即每9mLMaleicacidbuffer中加入1mL10×Blockingsolution混匀，现配现用；3)按1ml/cm2的量取用1×Blocksolution，处理膜30min；4)将4#试剂离心，按1：5000加入1×Blockingsolution，按20ml/100cm2的量用antibodysolution处理膜30min；5)每次按1ml/cm2的量用Washingbuffer洗膜2次，每次15min；6)按20ml/100cm2的用量，膜在detectionbuffer中平衡2-5min；7)准备Color-substratesolution（显色液）：从试剂5#中取100µL到5mLDetectionbuffer，要避光，现配现用；8)按10mL/100cm2的量加入新鲜配制的colorsolution浸润膜，放在塑料袋或塑料盒中，保持黑暗，注意不要在显色过程中摇动!9)颜色沉淀在几分钟内开始出现，在16小时内完成显色反应，在显色过程中膜可在光亮处短暂暴露几次。当预期的斑点出现时，可在50mLTEbuffer或无菌超纯水中洗膜5分钟中止反应；10)照像记录结果。