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第*’卷第#期’(年#月环!!境!!科!!学+,-./0,1+,23456.+,6+-7;B*’$,7B#5@CB$’(N株高效反硝化聚磷菌的生物学特性研究马放$’$杨菲菲’$李昂$崔潇$张倩*$姜欣欣$魏利$张晓昕‘哈尔滨工业大学城市水资源与水环境国家重点实验室$哈尔滨!)((#(’’‘辽宁大学环境学院$沈阳((*%’*‘武汉大学土木建筑工程学院$武汉!E*(($’#摘要!采用专性培养基$从稳定运行的3O0O35T/反应器中分离得到株高效的反硝化聚磷菌cD:LQ()B菌株cD:LQ()的%5L_,3序列登录Y@8TG8I$登录号为YW’E&’%B分析了该菌株的胞外聚合物的成分$探讨了C[(温度和碳源对株菌的生长及脱氮除磷效能的影响B结果表明$菌株cD:LQ()为芽孢杆菌$胞外聚合物以蛋白质为主$约’(‘%FU.F4o’核酸’*‘()’U.F4o$多糖极少且对磷酸盐无明显吸附作用$对磷的去除主要源于细胞内的吸收B当C[值为$$温度为*(n$碳源为乙酸钠时$最利于菌株生长$且同步脱氮除磷效果最佳B此时除磷率为&&j$脱氮率为&jB关键词!生物除磷’反硝化聚磷菌’胞外聚合物’C[’温度’碳源中图分类号!^$’!文献标识码!3!文章编号!(’)(D**(’(#(#D’$(D(%收稿日期#’((D(D’(’修订日期#’((DD$基金项目#国家水体污染控制与治理科技重大专项’((&Z^($’(’D(()#’国家自然科学基金项目)($$&()’#’城市水资源与水环境国家重点实验室开放课题项目c3’((&(#作者简介#马放#%*f#$男$教授$博士生导师$主要研究方向为环境微生物学$+DFGA;!FGRG8UK:A9B@?BM8[’+4+9’7E4-0E&E7)%&’,)’7,+15%(’)&’1J’(92+4J$0+,$0E)%.E77#6#4E)’(9C&9E(’,6,13=G8U$’$X3,Y=@ADR@A’$4.38U$6W.^AG7$Z[3,YcAG8*$\.3,Y^A8DJA8$a+.4A$Z[3,Y^AG7DJA8‘59G9@]@4GQ7LG97L7RWLQG8aG9@L/@N7LM@G8?+8SAL78F@89$[GLQA8.8N9A99@7R2@M:87;7U$[GLQA8)((#($6:A8G’’‘5M:77;7R+8SAL78F@89G;5MA@8M@$4AG78A8UW8AS@LNA9$5:@8G8U((*%$6:A8G’*‘5M:77;7R6ASA;+8UA8@@LA8U$a:G8W8AS@LNA9$a:G8E*(($’$6:A8G#3,)&E7)!3?@8A9LARA8UC:7NC:G9@DGMMF;G9A8U7LUG8ANFN_,V30N#$P:AM:PGNMG;;@?cD:LQ()$PGNAN7;G9@?A89:@NC@MAG;F@?AFRL7F9:@G8G@L7QAMOG@L7QAMOG87JAM5T/L@GM97LB59LGA8cD:LQ()PGNA?@89ARA@?Q%5L_,3U@8@G8G;NAN$G8?9:@GMM@NNA788FQ@L7R%5L_,3U@8@N@d@8M@7RN9LGA8cD:LQ()A8Y@8TG8IPGNYW’E&’%B+RR@M9N7R9:@?ARR@L@89C[SG;@N$9@FC@LG9L@$MGLQ78N7LM@7RF@?AF788A9L7U@8G8?C:7NC:7LNL@F7SG;7RN9LGA8cD:LQ()P@L@A8S@N9AUG9@?B2:@L@N;9N:7P@?9:G9N9LGA8cD:LQ()Q@;78U@?97K$2&++#NCBB1@G8P:A;@$@J9LGM@;;;GL@J7C7;F@LN7RN9LGA8cD:LQ()PGNQGN@?78CL79@A8$GQ79’(‘%FU.F4o$G8?A9:G?’*‘()’U.F4o8M;@AMGMA?$Q9;A99;@C7;NGMM:GLA?@B2:@L@PGN87NAU8ARAMG89G?N7LC9A787RC:7NC:G9@B57C:7NC:7LNL@F7SG;PGNFGA8;?@97A89LGM@;;;GLC9GI@B38?P:@8C[SG;@PGNI@C9GN$$9@FC@LG9L@PGNI@C9GN*(n$G8?MGLQ78N7LM@PGNI@C9N7?AFGM@9G9@$9:@:AU:@N98A9L7U@8G8?C:7NC:7LNL@F7SG;@RRAMA@8MPGNGM:A@S@?BV:7NC:7LNC9GI@LG9@PGNGS@LGU@?G9&&j$G8?9:@?@8A9LARAMG9A78LG9@L@GM:@?&jBA%JM+&*,!QA7;7UAMG;C:7NC:7LNL@F7SG;’?@8A9LARA8UC7;C:7NC:G9@DGMMF;G9A8U7LUG8ANFN’+V5’C[’9@FC@LG9L@’MGLQ78N7LM@!!氮和磷的超标排放是造成水体污染和富营养化的主要原因之一)$’*B常规的生化处理工艺对污水中同时存在的,(V等营养物只能去除(jf’(j$大量含磷污水直接排入水体)**B因此$如何高效(经济的脱氮除磷已经成为水污染防治领域的热点研究方向B生物法脱氮除磷是近年来研究的重点B国内外学者不断致力于生物法脱氮除磷工艺的研究$典型代表有3O0(3’O0(W62(五段TGL?@8C:7(V:7N9LAC等$但是大多数污水处理厂经常单凭经验改变工艺参数$没能从微生物生理生态学的角度来调控工艺B目前$在菌种的育选方面$已经发现了多种不同类型的反硝化菌和聚磷菌)E*B]QG等))*在研究中发现$在厌氧O缺氧交替的运行条件下$比较容易富集一类兼有反硝化作用和除磷作用的兼性厌氧微生物$称为反硝化聚磷菌$简称_,V30NB认为其既能以氧气又能以硝酸盐作为电子受体$在吸磷的同时进行反硝化B从而反硝化聚磷菌的出现导致了反硝化脱氮除磷理论的提出$这也意味着有希望解决传统除磷脱氮工艺自身无法解决的矛盾$也将改变传统污水处理工艺+以能耗能,这一事实B本研究分析了株高效的反硝化聚磷菌的生物学特性$探讨了菌株的胞外聚合物成分及生物影响因子$以期为反硝化聚磷菌应用于工程实践提供理论依据$为开发新型生物脱氮工艺提供技术支持BNO材料与方法NPN!样品来源从实验室运行稳定的厌氧O好氧O缺氧3O0O#期马放等!株高效反硝化聚磷菌的生物学特性研究3#5T/反应器中取活性污泥作为实验样品B取样时此反应器运行状态良好$1455保持在)#&FU.4o左右$缺氧段结束后排泥B实验温度保持在’’s’#n$反应器内C[值保持在$‘(s(‘’通过加入(‘)F74O4的[6;或(‘)F7;.4o的,G0[来调节#B进水60_平均为’)(f*((FU.4o$V0*oEDV平均为’f)FU.4o$,[zED,平均为%)f$(FU.4oB出水60_平均为E(f%(FU.4o$V0*oEDV平均为’f$FU.4o$,[zED,平均为$f*(FU.4oBNPQ!培养基反硝化培养基)%*!柠檬酸钠)‘(U’]’[V0E‘(U’][’V0E‘(U’1U50E.$[’0(‘’U’],0*’‘(U’琼脂’(U’[’0(((F4’C[$‘’B缺磷培养基V0*oEDV’‘*FU.4o#)$*!6[*600,G.*[’0*‘’*U’,G’[V0E.’[’0’*FU’,[E6;)’‘&FU’1U50E.$[’0&‘’FU’]’50E$‘&*FU’6G6;’.’[’0FU’[+V+5QRR@L$U’微量元素’F4’[’0(((F4’C[$‘(B富磷培养基V0*oEDV’E‘)FU.4o#)$*!6[*600,G.*[’0*‘’*U’][’V0E’)FU’,[E6;*()‘)’FU’1U50E.$[’0#‘’%FU’6G6;’.’[’0’)‘%&FU’V.V+5QRR@L&‘)U’微量元素’F4’[’0(((F4’C[$‘(B硝酸盐还原实验培养基!牛肉膏*U’蛋白胨)U’],0*U’[’0(((F4’C[$‘’BNPR!反硝化聚磷菌的分离与筛选从5T/反应器中取(F4活性污泥至装有#(F4无菌水和玻璃珠的三角瓶中$充分振荡以打碎活性污泥B经倍比稀释$分别在反硝化培养基上采用混均平板法培养’f*?$选择合适的稀释梯度要求平板上菌落分布均匀$即菌落数在*(f*((#$挑取形态清晰的单菌落纯化$直至菌落特征一致$无异常菌落出现$最后接种到斜面培养基上培养保存以备用B对已分离的各菌株进行吸磷$脱氮实验(硝酸盐还原产气实验及V[T颗粒染色辅助检验相结合的方法进行筛选B其中除磷率的测定方法为!取斜面菌种$首先在缺磷的培养基中进行预培养B培养物在摇床上*(n$E(LOFA8过夜培养B将菌体细胞以&(((LOFA8离心$之后用无菌蒸馏水洗涤菌体细胞$重新悬浮于富磷培养基中$整个过程均在无菌条件下进行’然后装入密闭容器中$*(n下摇床中扩大培养$进行缺氧吸磷实验$培养’:后$各取(F4菌液离心$取澄清的无菌上清液按钼锑抗分光光度法测定接种后V0*oEDV含量的变化B菌株反硝化效能的测定方法!取斜面菌种$在不含乙酸钠的富磷培养基中加入],0*,0o*D,浓度为&’FU.4o#$缺氧状态下培养’:$检测培养液中,[zED,(,0o*D,(,0o’D,浓度变化B,[zED,!纳氏试剂光度法’,0o*D,!麝香草酚分光光度法’,0o’D,!9DD萘基#D乙二胺分光光度法BNPW!菌株生理生化鉴定菌株生理生化特性的鉴定参照文献)&*方法进行BNPX!%5L_,3序列的克隆与测序采用试剂盒法上海华舜生物技术有限公司#提取菌株_,3$利用通用引物T3(=OT3)*E/大连宝生物公司合成#进行V6/)#*扩增B通用引物序列为T3)*E/!)hD322366Y6YY62Y62YYD*h’T3(=!)hD2YY6YY36YYY2Y3Y233D*h#B反应体系及条件见文献)($*B然后进行连接转化$最后测序由大连宝生物公司完成#B将测序结果用T4352软件与Y@8TG8I中已登录的%5L_,3序列进行相似性比较B采用6;N9G;^‘&进行多序列比对$1+Y3E‘软件中的,\法构建进化树BNP!!菌株的特性研究NP!PN!菌株胞外聚合物的测定)’*胞外聚合物的提取实验!取’)F4的cD:LQ()菌液$利用超声破碎仪$E(a$%(N进行超声破碎B再把菌液在’((((LOFA8(En下$离心’(FA8$收集上清液$测定蛋白质(多糖及核酸的含量B蛋白质浓度测定采用TLG?R7L?试剂盒进行蛋白质含量测定!取(’4样品$与(’4VT5混合$加入’((’4TLG?R7L?/@GU@89$混匀$室温放置)FA8$用分光光度计在)#)8F处读数B多糖的测定采用苯酚硫酸法!取‘(F4样品$与‘(F4蒸馏水混合$加入质量分数为%j的苯酚溶液‘(F4及浓硫酸)‘(F4$静止(FA8$摇匀$再静止)FA8$沸水浴加热’)FA8后$用冷水迅速冷却)FA8$于E#(8F测吸光度$以’‘(F4蒸馏水按同样操作显色作为空白B核酸测定采用紫外分光光度法!取’’4样品$与E&’42+溶液混合$在’%(8F处读数$测定其紫外光吸收值Y’%(8F$以)(’42+溶液作为空白BNP!PQ!生长曲线及脱氮除磷的影响因素采用光电比浊法$利用$’’型分光光度计以Y%((值表示BC[值分别设置为E()(%($(&(#((’温度分别设置为’((’)(*((*)(E(n’碳源分别设置为乙酸钠(丙酸钠(丁二酸钠(葡萄糖B将筛选所得的_,V30N活化&:$在每种条件下以(j的接种$’环!!境!!科!!学*’卷量接入到含有],0*,0o*D,浓度为&(FU.4o#的富磷培养基中$恒温(摇床培养E&:后$测定各细菌悬浮液的Y%((值及培养基中氮磷的变化BQO结果与分析QPN!菌株的分离与筛选以厌氧O好氧O缺氧3O0O3#5T/