1株贫营养好氧反硝化菌的分离鉴定及其脱氮特性魏巍

生态环境学报2010,19(9):[e-mail]基金项目：国家重大科技专项（2009ZX07424-006-003）；国家自然科学基金项目(50830303；50778147）；西安市科技计划项目(SF08022)；教育部博士点新教师基金项目(20096120120013）作者简介：魏巍(1976年生)，女，讲师，博士研究生，主要研究方向为水处理与水质微污染控制。E-mail：[e-mail]收稿日期：2010-08-191株贫营养好氧反硝化菌的分离鉴定及其脱氮特性魏巍，黄廷林，苏俊峰，王春燕，黄卓，李娜西安建筑科技大学//西北水资源与环境生态教育部重点实验室，陕西西安710055摘要：从水库底泥样品中，以硝酸盐为唯一氮源进行驯化、分离筛选出1株能在贫营养及好氧条件下进行高效反硝化的菌株PY8，经过电镜形态学观察、生理生化和16SrDNA序列分析，并基于16SrDNA序列结果，构建了该菌株的系统发育树，最终确定菌株PY8为根瘤菌Rhizobiumsp.。考察了初始pH值、温度、C/N、初始硝酸钠质量浓度、投菌量对菌株PY8硝酸盐还原活性的影响，以及该菌株的异养硝化性能。结果表明，在pH6.0~10.0，温度25~30℃，C/N1.0~9.0，初始硝酸钠质量浓度0.01~0.50g·L-1，投菌量1%~15%时，菌株PY8培养72h后的硝氮去除率可达到95%以上。另外，该菌株具有同时硝化-反硝化作用，在培养过程中氨氮去除率可达到58%左右。实验结果表明，菌株PY8在微污染水体生物脱氮领域中具有很大的应用潜力。关键词：好氧反硝化菌；16SrDNA；系统发育分析；脱氮特性；异养硝化中图分类号：X172文献标识码：A文章编号：1674-5906（2010）09-2166-06随着水体富营养化问题的日益加剧，脱氮已成为水污染控制领域的重要课题[1-3]，而生物脱氮法由于具有高效、低耗的特点，因而成为饮用水源脱氮处理中经济有效的方法之一[4]。目前，关于污染环境的生物脱氮理论与技术已有不少研究报道[4-6]，而关于在贫营养条件下进行反硝化的高效脱氮细菌的报道则相对较少。一般认为，生物脱氮包括好氧硝化和缺氧反硝化两个过程。一直以来，反硝化被看作只有在厌氧或缺氧条件下才能实现。在有氧条件下以O2为电子受体，只有在缺氧条件下才以硝酸盐或亚硝酸盐为电子受体，进行反硝化作用。但是近年来，好氧反硝化现象不断被报道，并且其中的一些好氧反硝化菌已经被筛选出来，目前国外已发现的好氧反硝化菌有Thiosphaerapantotropha、Alcaligenesfae-calis、Pseudomonasnautical、Thaureamecher-nichensis和Microvirgulaaerodenitrificans等[7-12]。本文从水库底泥中经驯化、分离和纯化得到1株能在贫营养及好氧条件下进行高效反硝化的菌株PY8，通过对菌株形态、培养、脱氮特性和生理生化特性及结合16SrDNA序列分析对该菌进行了研究，为其将来应用于水源水生物脱氮提供理论依据。1材料与方法1.1材料1.1.1菌种好氧反硝化菌PY8，由本实验室筛选得到。1.1.2仪器空气振荡培养箱BS-1E(常州国华电器有限公司)；DR5000紫外可见分光光度计(美国哈希公司)。1.1.3试剂均为国产分析纯。1.2方法1.2.1培养基选择性液体培养基(w/(g·L-1))：乙酸钠0.1，NaNO30.02，K2HPO40.02，CaCl20.01，MgCl20.01，pH7.0~7.5。BM培养基(w/(g·L-1))：乙酸钠0.2，NaNO30.04，K2HPO40.04，CaCl20.02，MgCl20.02，琼脂粉18，pH7.0~7.5。FJ培养基(w/(g·L-1))：乙酸钠0.5，NaNO30.1，K2HPO40.1，CaCl20.05，MgCl20.05，pH7.0~7.5。XJ培养基(w/(g·L-1))：乙酸钠0.5，NH4Cl0.1，K2HPO40.1，CaCl20.05，MgCl20.05，pH7.0~7.5。1.2.2菌种的驯化与筛分取适量底泥样品加入至装有1000mL新鲜选择性液体培养基的容器内。在驯化过程中逐步改变营养物及溶解氧质量浓度，使生物菌群有一个适应的过程，最终使目的菌群成为优势菌群，来达到富集的目的。驯化结束后，倒平板反复进行划线分离，重复5个周期后分离纯化出单一菌株。1.2.3菌株硝酸盐降解及生长曲线的测定斜面菌种经活化后，按体积比10%的量接入1000mLFJ培养基中，于30℃、120r·min-1空气振荡培养箱中培养，在不同时间检测菌液的硝酸盐氮DOI:10.16258/j.cnki.1674-5906.2010.09.030魏巍等：1株贫营养好氧反硝化菌的分离鉴定及其脱氮特性2167质量浓度和A600，以未接入菌的空白FJ培养基为对照。1.2.4好氧条件下菌株PY8反硝化特性研究不同初始pH实验：配制不同初始pH的培养基，使其初始pH分别为5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，接入活化后的菌株PY8，培养24、48和72h后分别检测硝酸盐氮质量浓度。不同温度实验：在FJ培养基中，接入经活化的好氧反硝化菌PY8，分别在15、20、25、30和35℃空气振荡培养箱中培养，在24、48和72h时分别检测硝酸盐氮质量浓度变化情况。不同碳氮比实验：在FJ培养基中，保持NaNO3质量浓度不变，通过改变乙酸钠质量浓度来改变C/N(质量比)，使C/N分别为1.0、1.5、3.0、4.5、6.0、9.0，分别向不同碳源质量浓度培养基中接入活化的菌株PY8，于30℃、120r·min-1空气振荡培养箱中培养，在24、48和72h时分别检测硝酸盐氮质量浓度。不同初始NaNO3质量浓度实验：在FJ培养基中，保持C/N为2.0，使加入的NaNO3质量浓度分别为0.01、0.02、0.04、0.10、0.20和0.50g·L-1，接入活化的菌株PY8，培养24、48和72h时分别检测硝酸盐氮质量浓度变化情况。不同接种量实验：在FJ培养基中，按体积比1%、2%、5%、10%和15%的量接入经活化的好氧反硝化菌PY8，于30℃、120r·min-1空气振荡培养箱中培养，培养24、48和72h时分别检测硝酸盐氮质量浓度。1.2.5异养硝化性能实验在XJ培养基中，按体积比10%的量接入经活化的好氧反硝化菌PY8，在不同时间检测菌液的氨氮质量浓度、硝酸盐氮质量浓度和亚硝酸盐氮质量浓度的变化情况。1.2.6菌种的鉴定从形态学、生理生化和微生物分子生物学3个方面对该菌进行鉴定。利用扫描电子显微镜观察菌体的形态及大小。菌种鉴定采用16SrDNA基因序列分析，对该菌的基因组DNA进行PCR扩增的引物采用27f：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’和1492r：5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’。PCR反应条件为：985min℃；95℃35s，55℃35s，72℃1min，35个循环；72℃8min。得到的PCR扩增产物经过纯化后用w=1%的琼脂糖凝胶电泳检测。测序由上海生工生物工程有限公司完成。将测序结果用BLAST软件与GenBank中已登录的16SrDNA序列进行同源性比较。根据测序结果，利用NCBI提供的Blastn工具和Cluastx、PhyloDraw等相关软件在GenBank数据库中找到了同源序列[13]，并建立了系统发育树。2结果与讨论2.1菌种鉴定生理生化检测表明，菌株PY8革兰氏染色反应呈阴性，葡萄糖发酵产酸、蔗糖发酵产酸、硝酸盐还原、淀粉水解、产吲哚试验、尿素水解试验、产氨试验、产硫化氢试验和乙酰甲基醇试验(V.P.)呈阳性，明胶液化试验和甲基红试验(M.R.)呈阴性，石蕊牛奶试验结果为产酸。在扫描电子显微镜下，菌体呈圆杆状，无芽孢，大小：(0.40~0.83)µm×(0.67~1.80)µm，菌体常以一定角度成对或成串排列。在BM培养基上，培养5d时的菌落直径大约为4mm，圆形，边缘整齐；菌落呈乳白色，正反面均匀一致；表面湿润光滑，凸起；质地均匀，有光泽，无水溶性色素(图1)。对菌株PY8的16SrDNA进行PCR扩增,经过1%的琼脂糖凝胶电泳检测获得约1.5kb大小的产物。扩增产物回收后测序，得到16SrDNA的序列为1446bp。将测序结果用BLAST软件与GenBank中已登录的16SrDNA序列进行同源性比较。经16SrDNA测序及同源性比较，分离菌与多株Rhizobiumsp.的同源性大于99%。结合菌株的形态学和生理学特性，参照《伯杰细菌鉴定手册》[14]，最终可确定PY8菌株为根瘤菌Rhizobiumsp.，系统发育树结构如图2所示。2.2菌株硝酸盐降解及生长曲线培养过程中在不同时间取样分析FJ培养基中硝酸盐氮质量浓度和A600，分析硝酸盐降解及菌体生长情况，得到图3。细菌生长曲线表现出4个不同的生长时期：迟缓期、对数生长期、稳定生长期、衰亡期。从图3可以看出，菌株在接种后1d进入对数生长期，第13天时菌体质量浓度达到最大，随后进入稳定生长期，稳定生长期较长，反硝化过程主要发生在第0~2天，NO3--N在2d内全部被还原，脱氮率达到100%。由生长曲线可知，贫营养细菌的生图1扫描电子显微镜下菌株PY8的形态(×20000)Fig.1ThemorphousofstrainPY8obtainedbySEM2168生态环境学报第19卷第9期（2010年9月）长速率相当缓慢，有研究表明[15]，贫营养细菌的培养时间较长，少则7d，长则几个月。2.3初始pH对硝酸盐还原活性的影响pH可影响酶活、菌体对营养物质的吸收及菌体细胞的结构，从而影响菌体的生长和还原活性。pH还会影响反硝化作用的终产物，pH高于7.3时终产物为N2，pH低于7.3时终产物为N2O[16]。实验考察了初始pH对还原活性的影响(图4)。结果表明，pH6.0~10.0均可进行反硝化作用，培养48h后NO3--N全部被还原，说明菌株PY8能够适应的pH范围很宽，对pH的耐受能力很强。2.4温度对硝酸盐还原活性的影响温度影响微生物的生长及生命代谢活性。温度过低或过高都不适宜好氧反硝化菌的生长。一般来讲，在一定范围内，温度越高，微生物的活性越高，增殖速度越快。由图5可以看出，温度为25~30℃时菌株PY8的脱氮效果最好，硝氮去除率达到95%以上；温度为15~20℃的条件下，菌株PY8的脱氮效率仍可达到45%~70%左右，说明该菌株对温度的适宜范围较宽，这样的宽温度范围有利于菌体在环境中的竞争与存活，能够有效地发挥该菌的好氧反硝化能力。2.5碳氮比对硝酸盐还原活性的影响碳源在反硝化过程中起电子供体及合成细胞物质的作用，在一定质量浓度范围内作为能源的有机碳源质量浓度越高，好氧反硝化菌的反硝化速率就越快[17]。实验中NO3--N质量浓度定为15mg·L-1左右，通过改变乙酸钠质量浓度来改变C/N(质量比)，考察了C/N对硝酸盐还原活性的影响，结果见图6。从图6可以看出，菌株PY8在C/N为1.0~9.0时均具有较好的反硝化性能，碳氮比越高反硝化速率越快，C/N不低于3.0时，培养24h后NO3--N全部被图3菌株PY8的硝酸盐降解及生长曲线Fig.3CharacteristicsofnitratedegradationandgrowthcurvebystrainPY8图5温度对硝酸盐还原活性的影响Fig.5EffectoftemperatureonnitratereductionactivityPY8NZACMH01000177Rhizobiumsp.NZACME01000092Rhizobiumsp.NZACNC01000278Rhizobiumsp.0.02图2菌株PY8同相近序列采用NJ