07第七章微生物的生长繁殖

第七章微生物的生长繁殖生长和繁殖统称为发育，发育是一个复杂的生命活动。当微生物吸收营养物质后，通过合成代谢作用，合成新的细胞成分，使菌体的重量增加(主要是原生质和其他组成成分有规律地增加)，菌体体积长大，这种现象称为生长。细胞的生长是有限度的，当细胞增长到一定程度时就开始分裂，这种菌体数量增多的现象称为繁殖。生长是繁殖的基础，繁殖是生长的结果。生长和繁殖虽有区别，但关系十分密切。微生物群体在生长过程中，个体的细胞体积和重量变化不易被察觉，所以，常以细胞数量的增加或以细胞群体重量的增加作为生长繁殖的指标。3生长：生物个体物质有规律地、不可逆增加，导致个体体积扩大的生物学过程。繁殖：生物个体生长到一定阶段，通过特定方式产生新的生命个体，即引起生命个体数量增加的生物学过程。45•微生物生长：在一定时间和条件下细胞数量的增加（微生物群体生长），在微生物学中提到的“生长”，一般均指群体生长，这一点与研究大生物时有所不同。•微生物生长：单位时间里微生物数量或生物量的变化。第一节微生物纯培养的生长微生物学中将在实验室条件下，从一个细胞或一种细胞群繁殖得到的后代称为纯培养。相对应的称为不纯培养物。纯培养的分离方法稀释倒平皿法将待分离的材料作一系列稀释(如1:10、1:100、1:1000、1:10000…)，取不同稀释液各少许与已熔化并冷却至45℃的琼脂培养基相混合，倾入灭过菌的培养皿中，待琼脂培养基凝固后，保温培养一定时间，微生物纯培养的生长即有菌落出现。如果稀释得当，平皿中出现分散的单个菌落便可能是由一个细菌繁殖所形成。挑取此单个菌落或再重复以上操作数次，可得到纯培养。微生物纯培养的生长划线法将熔化的琼脂培养基倾入无菌培养皿中，冷凝后，用接种环蘸取少许待分离材料，在培养基表面连续划线，如，可作平行划线、扇形划线或其他形式连续划线，随着接种环在培养基上的移动，细菌得以分散，经保温培养即形成菌落。在划线的开始部分，细菌分散度小，形成菌落往往连在一起。但由于连续划线，细菌逐渐减少，划到最后常可形成单独孤立的菌落。微生物纯培养的生长这种单独的菌落可能是由单个细胞形成的，因而获得纯培养。用其他工具如形玻棒代替接种环在琼脂培养基表面涂布，亦可得到同样结果。微生物纯培养的生长单细胞挑取法单细胞挑取法是从待分离材料中只挑取一个细胞来培养。可用一台显微挑取器，装置于显微镜上，把一滴细菌悬浮液置于载玻片上，用装于显微挑取器上的极细的毛细吸管，在显微镜下对准一个单独的细菌细胞挑取，再接种于培养基上培养而得纯培养。微生物纯培养的生长利用选择培养基分离法不同的细菌需要不同的营养物。因此，可以把培养基配制成适合于某种细菌生长而限制其他细菌生长的环境。这样的选择培养基可用来分离培养纯种。也可以将待分离的样品先进行适当处理，以排除不需要的微生物。例如，想分离得到芽孢细菌，可在倒平皿前将样品在高温处理一段时间，以破坏所有的或大部分的非芽孢细菌，这样分离得到的菌落将是芽孢形成菌。微生物纯培养分离方法的比较方法应用范围稀释倒平皿法即可定性，又可定量，用途广泛划线法方法简便，多用于分离细菌单细胞挑取法局限于高度专业化的研究利用选择培养基分离法适用于分离某些生理类型较特殊的微生物13第二节微生物的生长和测定方法1、测生长量：（1）直接法：测体积、称干重等方法（2）间接法：A测定细胞物质的重量采用干重法，用离心或过滤的方法将菌体从菌悬液中分离出来，洗净，烘干，称重，求得单位容积菌悬液中细胞的干重。这是测定细胞重量较为直接而可靠的方法，但只适用于菌体浓度较高的样品，而且要求样品中不含菌体以外的其他干物质。在活性污泥法中常采用干重法来测定活性污泥的重量，以近似代表活性污泥中微生物的量，这一指标称为活性污泥浓度(符号为MLSS)，它表示每升活性污泥混合液中活性污泥的毫克数。这种测定结果既包括活菌和死菌量，又包括有机颗粒和无机盐类的重量，因而，这一指标随非生物物质含量的增加，可靠性降低。15B比浊法：可用分光光度法对无色的微生物悬浮液进行测定或用带有侧臂的三角烧瓶作原位测定。16C生理指标法：如测含氮量：一般细菌的含氮量为其干重的14%，酵母菌为7.5%，霉菌为6.5%，含氮量乘以6.25即为粗蛋白含量。测含碳量以及测磷、DNA、RNA、ATP、DAP（二氨基庚二酸）、几丁质或N－乙酰胞壁酸等含量的；产酸、产气、耗氧、粘度和产热等指标，有时也应用于生长量的测定。微生物纯培养的生长DNA含量测定法由于DNA在细胞生长中起重要作用，所以，测定DNA的含量也是研究微生物生长的一种重要的化学测定方法。DNA的测定不但可以反映细胞物质的重量，并且由于每个细菌细胞中DNA含量对于某类群微生物来说较恒定(平均为8.4×10-5ｍｇ)，所以，通过测定细菌的DNA还可推算出细菌细胞的数量。此外，还可采用测定ATP的方法，但由于细胞内ATP含量随发育阶段的不同而变化较大，因而，用于反映微生物量不如DNA佳。182、计繁殖数：细菌酵母菌放线菌和霉菌孢子数（1）直接法：指用计数板（例如血球计数板）在光学显微镜下直接观察细胞并进行计数的方法。19A平板菌落计数法：（2）间接法（菌落计数法）：20•采用培养平板计数法要求：•每一活微生物单细胞在培养平板上培养后，形成一个单菌落，在科研中一般用菌落形成单位（colonyformingunits，CFU）来表示，而不是直接表示为细胞数。•技术要求高，烦琐。第二节微生物纯培养的生长规律细菌纯培养的生长曲线研究细菌纯培养的生长曲线是采用分批培养，或称为间歇培养(batchculture)。分批培养就是在一定体积的液体培养基中接种少量细菌并保持一定的条件(如温度、pH、溶解氧等)进行培养，结果出现了细菌数量由少到多，并达到高峰，又由多变少的变化规律。测定生长曲线时，将少量经纯培养的细菌接种到经灭菌的液体培养基中，在适宜条件下培养，定时取样测定细菌数量。以细菌数的对数为纵坐标，生长时间为横坐标，可得图所示的曲线。22一、单细胞微生物的典型生长曲线纯种单细胞微生物接种到恒容积的液体培养基中，定时测定菌体数量，以活菌数对数为纵坐标，以时间为横坐标绘图所得到的曲线，称为生长曲线。整个典型生长曲线可分为四个时期：延缓期、对数期、稳定期和衰亡期。241、迟缓期表现：不立即繁殖，菌数几乎不变，细胞形态变大。特点：生长速率常数为0，分裂迟缓，合成代谢活跃，体积增长快，细胞内RNA含量增高，对外界不良环境敏感，合成各种新的酶系和中间代谢产物。影响延滞期长短的因素：①菌种②接种龄③接种量④培养基成分25(1)通过遗传学方法改变种的遗传特性使迟缓期缩短；(2)利用对数生长期的细胞作为种子；(3)尽量使接种前后所使用的培养基组成不要相差太大；(4)适当扩大接种量在生产实践中缩短迟缓期的常用手段：微生物的生长曲线对数期(logphase)迟缓期末，细胞开始出现分裂，培养液中的菌数增加，进入对数期。在此时期，以细菌数的对数与培养时间做图则成一直线。对数期细菌按几何级数增加，1→2→4→8→…，即20→21→22→23→…2n。每分裂一次为一个世代，每经过一个世代，群体数目增加一倍。可见，细菌的群体生长是按指数速率进行的，因而亦称做指数增长。细菌群体的这种指数增长可用以下方程式表示微生物的生长曲线细菌群体的这种指数增长可用以下方程式表示：Ｘ2=Ｘ1·2ｎ式中：Ｘ1、Ｘ2——分别为时间ｔ1和ｔ2时刻的细胞数；ｎ——世代数。世代时间是由遗传性决定的，不同菌种对数期的世代时间不同，同一菌种的世代时间受培养基组成及物理环境的影响也不同。对数期细菌的生长速度达到高潮，世代时间最短，细胞的代谢活性比较稳定，酶的活力也高。这个时期的细胞是作为研究工作的理想材料。282、指数期：在生长曲线中，细胞数以几何级数增长的时期。表现：代谢活性最强，几何级数增加，代时最短，生长速率最大。特点：细菌数目增加与原生质总量增加，与菌液浊度增加呈正相关性。代时：单个细胞完成一次分裂所需时间，亦即增加一代所需时间。倍增时间：原生质增加一倍所需的时间29影响微生物增代时间（代时）的因素：1）菌种，不同的微生物及微生物的不同菌株代时不同；2）营养成分，在营养丰富的培养基中生长代时短；3）营养物浓度，在一定范围内，生长速率与营养物浓度呈正比；凡是处于较低浓度范围内，可影响生长速率的营养物成分，就称为生长限制因子。4）温度，在一定范围，生长速率与培养温度呈正相关。30大肠杆菌在不同温度下的代时温度（℃）代时（min）温度（℃）代时（min）101520253086012090402935404547.52217.52077313、稳定期表现：新增殖细胞数与老细胞的死亡数几乎相等，活菌数动态平衡。特点：生长速率又趋于0，细胞总数最高。合成各类次生代谢物。原因：养分减少；营养物比例失调，有毒代谢物产生，培养环境条件中pH和氧化还原电位等对细菌生长不利。32应用意义：1）发酵生产形成的重要时期（维生素、氨基酸等），生产上应尽量延长此期，提高产量，措施如下：•补充营养物质（补料）•调pH•调整温度2）稳定期细胞数目及产物积累达到最高。334、衰亡期表现：出现“负生长”，有些细胞开始自溶。衰亡期特点：细菌代谢活性降低，细菌衰老并出现自溶，产生或释放出一些产物，如氨基酸、转化酶、外肽酶或抗生素等。细胞呈现多种形态，有时产生畸形，细胞大小悬殊，有些革兰氏染色反应阳性菌变成阴性反应等。34二、微生物的连续培养连续培养（continuousculture）：指在微生物的整个培养期间，通过一定的方式使微生物能以恒定的比生长速率生长并能持续生长下去的一种培养方法。又称开放培养，是相对单批培养、封闭培养而言的。单批培养（batchculture）或封闭培养（closedculture）：指将微生物置于一定容积的培养基中，经过培养生长，最后一次收获。典型生长曲线。35单批培养（封闭培养）：培养基一次加入，不予补充，不再更换。连续培养：在培养过程中不断的补充营养物质和以同样的速率移出培养物才能实现微生物连续培养。36连续培养器按控制方式分按培养器的级数分按细胞状态分按用途分内控制（控制菌体密度）：恒浊器外控制（控制培养液流速、以控制生长速率）：恒化器单级连续培养器多级连续培养器一般连续培养器固定化细胞连续培养器实验室科研用：连续培养器发酵生产用：连续发酵罐连续培养器的类型37概念：是一种根据培养器内微生物的生长密度，并借光电控制系统来控制培养液流速，以取得菌体密度高、生长速度恒定的微生物细胞的连续培养器。原理：通过调节新鲜培养基流入的速度和培养物流出的速度来维持菌浓度不变,即浊度不变。主要采用恒浊器，当浊度高时，使新鲜培养基的流速加快，浊度降低，则减慢培养基的流速。特点：基质过量，微生物始终以最高速率进行生长，并可在允许范围内控制不同的菌体密度；但工艺复杂，烦琐。1、连续培养技术——恒浊培养使用范围：用于生产大量菌体、生产与菌体生长相平行的某些代谢产物，如乳酸、乙醇等。38恒浊连续培养测定所培养微生物的光密度值自动调节新鲜培养基流入和培养物流出培养室的流速使培养物维持在某一恒定浊度当培养室中的浊度超过预期数值时，流速加快，使浊度降低；当培养室中的浊度低于预期数值时，流速减慢，使浊度升高；恒浊培养器的工作精度是由光电控制系统的灵敏度来决定的如果所用培养基中有过量的必需营养物，就可以使菌体维持最高的生长速率。39一般用于菌体以及与菌体生长平行的代谢产物生产的发酵工业使用范围：用于生产大量菌体、生产与菌体生长相平行的某些代谢产物，如乳酸、乙醇等。402、连续培养技术——恒化连续培养概念：以恒定流速使营养物质浓度恒定而保持细菌生长速率恒定的方法。原理：通过控制某一种营养物浓度（如碳、氮源、生长因子等），使其始终成为生长限制因子，而达到控制培养液流速保持不变，并使微生物始终在低于其最高生长速率条件下进行生长繁殖。特点：维持营养成分的亚适量，控制微生物生长速率。菌体生长速率恒定，菌体均一、密度稳定，产量低于最高菌体产量。应用范围：实验室科学研究41恒化连续培