531PCR技术

2主要核酸操作技术核酸分离核酸凝胶电泳技术PCR技术DNA/cDNA文库的构建基因克隆技术DNA序列分析技术突变位点的检测第三节PCRPolymeraseChainReaction聚合酶链式反应英文？中文？提问？？PCR与DNA复制过程有何联系？ContentofTable一、PCR的定义二、PCR原理三、PCR反应五要素四、PCR的标准反应体系五、PCR热循环条件的选择六、PCR的类型七、PCR技术的应用一、PCR的定义在引物指导下由DNA聚合酶催化的对特定DNA序列进行的体外扩增反应。PCR动画讨论？？PCR原理？？PCR与DNA复制过程的区别？？两条引物与模板之间的关系？？产物的长度取决于哪个因素？为什么？ContentofTable一、PCR的定义二、PCR原理三、PCR反应五要素四、PCR的标准反应体系五、PCR热循环条件的选择六、PCR的类型七、PCR技术的应用二、PCR原理•类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。•模板DNA变性：•加热到临近沸点的温度，双链DNA解离成单链；•模板DNA与引物的退火(复性)：•引物与模板DNA单链的互补序列配对结合（依据引物的Tm值摸索退火温度）；•引物的延伸：•在TaqDNA聚合酶作用下，以dNTP为原料，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的双链；二、PCR原理•重复循环变性--退火--延伸三过程，使DNA扩增量呈指数上升。PCR反应曲线•当重复30-40个循环后，DNA扩增量达到平台期。PCRproductPCR动画讨论？？两条引物与模板之间的关系？？产物的长度取决于哪个因素？为什么？？PCR与DNA复制过程的区别？ContentofTable一、PCR的定义二、PCR原理三、PCR反应五要素四、PCR的标准反应体系五、PCR热循环条件的选择六、PCR技术的应用七、PCR的类型三、PCR反应五要素•酶（TaqDNApolymerase）•引物（primer）•dNTP（dATP,dGTP,dCTP,dTTP）•模板（template）•Mg2+（magnesium）•超纯水（ddH2O）（一）酶及其浓度•TaqDNA聚合酶•是从火山温泉一种水生栖热菌(Thermusaquaticus)中分离。•该酶有良好的热稳定性，在PCR循环的高温条件下仍能保持较高的活性。•一个典型的PCR反应（100μl反应体系）约需酶量2.5U。•浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少。（二）引物•引物是PCR特异性反应的关键。•PCR产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。•引物的设计软件：PrimerPremier5.0和Oligo6等生物学软件。引物设计的原则（了解）①引物长度：15-30个碱基，常为20个碱基左右；②引物扩增跨度：以500bp为宜，特定条件下可扩增长至10kb的片段；③引物碱基：G+C含量以40-60%为宜,ATGC最好随机分布；④避免引物内部出现二级结构：避免两引物间互补，特别是3`端；⑤引物3`端的碱基要求严格配对，特别是最末及倒数第二个碱基；⑥引物中可以加上合适的酶切位点；⑦引物的特异性：引物应与核酸序列数据库、模板的其它序列无明显同源性。ContentofTable一、PCR的定义二、PCR原理三、PCR反应五要素四、PCR的标准反应体系五、PCR热循环条件的选择六、PCR的类型七、PCR技术的应用四、PCR的标准反应体系•10×扩增缓冲液2.5μl•4种dNTP混合物各50μmol/L•引物2.5～25pmol•模板DNA0.25～0.5μg•TaqDNA聚合酶0.5-1U•Mg2+1.5mmol/L•加双或三蒸水至25μlContentofTable一、PCR的定义二、PCR原理三、PCR反应五要素四、PCR的标准反应体系五、PCR热循环条件的选择六、PCR技术的应用七、PCR的类型五、PCR热循环条件的选择•PCR反应条件（程序）:–温度–时间–循环次数温度与时间的设置设置变性-退火-延伸三个温度点：标准反应中采用三温度点法：1）93-95℃变性；2）40-60℃退火；3）70-75℃延伸对于较短靶基因（长度为100～300bp时）可采用二温度点法，一般采用94℃变性，65℃左右退火与延伸引物的复性温度1、Tm值的计算（了解）：•当引物长度为15-20nt时，Tm=4*（G+C）＋2*（A+T）•对于更长的寡聚核苷酸，Tm计算公式为：Tm=81.5+0.41(%GC)–600/size2、复性温度=Tm值-（5～10℃）--温度梯度•复性时间一般为30～60sec，足以使引物与模板之间完全结合。93-95℃预变性1-2min；1）93-95℃变性~1min；2）40-60℃退火~1min；25~403）70-75℃延伸~1min；72℃延伸~10min。标准PCR反应程序ContentofTable一、PCR的定义二、PCR原理三、PCR反应五要素四、PCR的标准反应体系五、PCR热循环条件的选择六、PCR的类型七、PCR技术的应用六、PCR的类型•反转录PCR(ReverseTranscriptionPCR,RT-PCR)•反向PCR（InversePCR，IPCR）•锚定PCR(AnchoredPCR，APCR)•不对称PCR(AsymmetricPCR)•巢式PCR(NESTPCR)•差示PCR(differentialPCR,d-PCR)•实时定量PCR•......ContentofTable一、PCR的定义二、PCR原理三、PCR反应五要素四、PCR的标准反应体系五、PCR热循环条件的选择六、PCR的类型七、PCR技术的应用七PCR技术的应用•生命学科•医学工程•遗传工程•疾病诊断•法医学•考古学•……思考题•简述PCR技术的原理？•请设计扩增目的片段为300bp的PCR实验（包括PCR反应体系、PCR反应程序）？