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·154·中华预防医学杂志2017年2月第51卷第2期ChinJPrevMed,February2017,Vol.51,No.2·论著·2013—2014年上海市污水中人类肠道病毒的基因型分布李云逸陆菁王秀芝杨玉颖费洁张莉萍李智李崇山左勇【摘要】目的分析上海市闵行和嘉定区污水处理厂中人类肠道病毒(HEV)的时间分布特点及其基因分型。方法于2013—2014年,选取闵行和嘉定区两所污水处理厂入水口作为采样点,每月24—28日采集污水标本1份,每份1L,共48份。经阴离子膜吸附的方法浓缩,再用牛肉汤洗脱,取上清液并接种RD、HEp-2和L20B细胞进行病毒分离,共分离HEV249株,其中非脊髓灰质炎病毒(NPEV)185株,脊髓灰质炎病毒(PV)64株(均为疫苗相关株)。通过RT-PCR鉴定基因型,采用Bioedit7.0.0对VP1核苷酸序列进行序列同源性分析,使用MEGA5.0软件,通过邻位法构建系统发生树,分析优势株及病毒传播链。结果185株NPEV中178株鉴定出基因型,包括:柯萨奇B组病毒(CVB)2、3、5基因型,埃可病毒(ECHO)1、3、6、7、11、13、19、20、24、25、30基因型,柯萨奇A组病毒(CVA)4基因型。CVB5和ECHO6是在NPEV分离株中比例较高的两个基因型,分别占33.5%(56株)和24.9%(43株)。闵行区污水水样中HEV分离株主要集中在4—9月份,其中优势株ECHO6主要分布在2013下半年和2014上半年采集水样中,优势株CVB5主要在2013—2014年散在分布。嘉定的ECHO6和CVB5两个优势株的流行趋势与闵行区的基本一致。2013—2014年CVB5形成C6和C8基因亚型2个传播链,而与国外毒株有较大的差异;ECHO6形成C3、C6和D9基因亚型3个传播链,而D9基因亚型在上海属于优势基因亚型,在国内外有一定地域性的传播。结论2013—2014年上海市污水中的分离到的PV均为疫苗株。HEV优势株为CVB5和ECHO6,其中ECHO6在2013下半年和2014上半年较为流行,CVB5在2014年下半年开始流行。CVB5和ECHO6存在多条传播链的共同流行现象。【关键词】肠道病毒属;柯萨奇病毒感染;艾可病毒感染;环境监测基金项目:上海市卫生和计划生育委员会项目(GWTD2015S01、15GWZK0101);全球健康-盖茨基金项目(OPP1039272)GenotypedistributionofhumanenterovirusesisolatedfromswageinShanghaiduringyear2013-2014LiYunyi*,LuJing,WangXiuzhi,YangYuying,FeiJie,ZhangLiping,LiZhi,LiChongshan,ZuoYong.*ShanghaiJiaoTongUniversitySchoolofMedicine,Shanghai200025,ChinaCorrespondingauthor:ZuoYong,Email:zuoyong@shsmu.edu.cn【Abstract】ObjectiveToexplorethetimeandgenotypedistributionofhumanenterovirus(HEV)isolatedfromsewageinShanghaiin2013-2014.MethodsOnesewagesampleeachwascollectedfromtwolocalsewageplantslocatedinMinhangDistrictandJiadingDistrictonthesamedayattheday24-28ofeverymonthfrom2013to2014.Eachsampleweighed1L.Thespecimenswereconcentratedbyanionicmembraneabsorption,elutedwithbeefextractsolution,andthenusedtoinoculateRD,HEp-2,andL20Bcelllines.Atotalof249enterovirusstrainswereisolatedfromsewagesamplesduringthestudyperiod,including185non-polioenterovirus(NPEV)and64poliovirus(PV)strains,whichwereidentifiedasvaccinestrains.RT-PCRandSangersequencingwereperformedtoidentifyHEVgenotypes.HomologousanalysisofVP1sequenceswasconductedusingBioEdit(version7.0.0).Phylogeneticanalysiswasperformedusingtheneighbor-joiningmethodbasedonthealignmentofVP1genesequencesusingMEGA(version4.0.2).ResultsAmong185NPEVstrains,178strainsweresuccessfullysequencedandclassifiedinto15genotypes,includingcoxsackievirusgroupB(CVB)2,3,and5;entericcytopathichumanorphan(ECHO)virus1,3,6,7,11,13,19,20,24,25,and30;andcoxsackievirusgroupA4.CVB5andECHO6genotypesDOI:10.3760/cma.j.issn.0253-9624.2017.02.011作者单位:200025上海交通大学医学院基础医学院(李云逸、王秀芝、左勇);上海市疾病预防控制中心病原生物检定所(李云逸、陆菁、杨玉颖、李崇山),免疫规划所(李智);上海市嘉定区疾病预防控制中心免疫规划科(费洁);上海市闵行区疾病预防控制中心免疫规划科(张莉萍)通信作者:左勇,Email:zuoyong@shsmu.edu.cn中华预防医学杂志2017年2月第51卷第2期ChinJPrevMed,February2017,Vol.51,No.2·155·accountedfor33.5%(56strains)and24.9%(43strains)ofNPEVisolates,respectively.Duringthestudyperiod,HEVisolatesweremainlyisolatedinsummerandautumninMinhangDistrict.ECHO6strainswerefrequentlyisolatedfromJune2013toJuly2014.Thereafter,thenumberofECHO6strainsgraduallyreducedinthesecondhalfof2014.CVB5strainsdemonstratedscattereddistributionfrom2013tothefirsthalfof2014andgraduallyincreasedinthesecondhalfof2014.ThedistributionofECHO6andCVB5strainsinJiadingDistrictwassimilartothatinMinhangDistrict.In2013-2014,CVB5strainscomprisedC6andC8subgenotypes,whichbelongtotwotransmissionchainsandshowlargedifferencescomparedwithforeignstrainsisolatedduringthesameperiod.ECHO6strainscomprisedC6,C8,andD9subgenotypes,whichbelongtothreetransmissionchains.Moreover,ECHO6subgenotypeD9wasadominantsubgenotypeinShanghai,withbroadgeographicaldistributionbothathomeandabroad.ConclusionPolioviruswasidentifiedasavaccinestraininenvironmentalsurveillancefromJune2013toApril2014inShanghai.SeveraltransmissionstrainsofECHO6andCVB5wereidentified,whichwerethedominantserotypes.【Keywords】Enterovirus;Coxsackievirusinfections;Echovirusinfections;EnvironmentalmonitoringFundprogram:ProjectofShanghaimunicipalhealthandFamilyPlanningCommission(GWTD2015S01,15GWZK0101);Globalhealth-GatesFundation(OPP1039272)人类肠道病毒(humanenterovirus,HEV)属于小RNA病毒科肠道病毒属。目前有100多个血清型,可分为HEV-A、B、C和D组[1]。CVA属于HEV-A组,ECHO、CVB属于HEV-B组,PV属于HEV-C组。HEV在全球广泛分布,无明显的地域差异。随着国际间各国交流愈加频繁,造成的HEV传播越来越多,病毒的变异速度加快。HEV可引起多种疾病,有些散在分布或者呈地区性暴发。国内外常有报道HEV爆发引起的疾病比如手足口病、无菌性脑膜炎(asepticmeningitis,AM)、急性出血性结膜炎(acutehaemorrhagicconjunctivitis,AHC)等[2-4]。HEV以隐形感染为主,受感染者都会持续向外环境排出带有病毒的粪便,大约持续数周。大量排到环境中的病毒颗粒依不同的环境条件而能够存活不同的时间,而在这段时间内保持感染性[5]。因此从污水中检测HEV在环境中的循环情况,可作为HEV流行病学研究的一个补充方法。HEV是相关领域研究的热点之一,目前很多国家已经开展环境污水监测研究,了解当地脊髓灰质炎病毒(poliovirus,PV)和非脊髓灰质炎病毒(non-poliomyelitisentero-viruses,NPEV)的循环状况及相关研究。而我国也有部分省市开展相关研究[6-7]。因此本研究选择闵行区和嘉定区污水厂作为采样点,进行污水标本的采集和HEV的检测,通过测序获得的病毒株VP1编码区序列,初步探讨上海环境污水监测对HEV感染性疾病防控的意义。材料与方法1.污水标本的采集与浓缩:于2013年1月至2014年12月,选取闵行区和嘉定区两所污水处理厂入水口作为采样点,每月(24—28日之中的一天)采集污水标本1份,每份1L,共采集48份。冷藏条件下运送到实验室,24h内采用阴离子膜吸附法浓缩污水标本和超声波振荡法浓缩污水标本[8]:将1000ml污水在4℃1840×g下离心30min;收集上清液,加入2.5mol/LMgCl2溶液至终浓度0.05mol/L,并用0.5mol/LHCl调整pH值到3.5;利用正压力使上清液经0.45μm的硝酸纤维素膜(ADVANTEC,A045A142C,日本)过滤;将滤过后的硝酸纤维素膜剪碎至1mm2碎片,放入10ml质量分数为3%的牛肉膏浸出液中,超声振荡洗脱2次;将洗脱液在1840×g离心30min;上清液以0.22μm无菌滤膜(Millipor
本文标题:20132014年上海市污水中人类肠道病毒的基因型分布
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