ANAMMOX菌的微生物学研究进展赵志宏

微生物学通报2)(X7年34(l)ANAMMOX菌的微生物学研究进展’赵志宏李小明`*廖德祥邓缤李旭(湖南大学环境科学与工程院长沙140028)摘要:厌氧氨氧化具有运行成本低、节约能源和资源的特点,是目前最有前途的脱氮途径。厌氧氨氧化是一个生物过程,已确定的细菌有3种:B,adia、K此、几池和Sca红耐au。综述了其分离和鉴定的方法、生物化学途径、生态生理学特性和分布。关键词:厌氧氨氧化,浮霉状菌目,PCR,厌氧氨氧化体中图分类号:x703文献标识码:A文章编号:0253一2654(2007)01刁一38习5TheMicrobiologyReseacrhrPogr侧粥ofANAMMOXBacteira’ZHAOZhi一HongLlXiao一Ming`’LIAODe一XiangDENGPinLlXu(OCllegeofE二iornmentalSeiccneadnE叮`。,ring,uHnanUni,,sr`t歹,Cha卿ha41图82)Abstarct:Anaeorbieam,niumoxidation(ANAMMOX)15anewp、essOfnitro罗neonvesrionhtathasp溉p,飞m喊cuerrn`ly.里’卜eAN-AMMOXp侧essoffesr解atopportunitiestoermoveammoniaofrmwastewaterwithou吸theadditionofanextemaleaobrnosucreandwitheon-5iderableles、aeartioneostsineomp丽osnwithelassie习meth记5.ANAMMOX15abiolo邵eallymediatedpocress.Th溉baeteiraaeridenti-ifedersponsibleofrthepocressasnewdeep一barneh一ngplanetomyeet。:B服ad她,K此附n记and女alindua.Descirbed一ttosepaarteandhtemethod,biochemis*卿path,theeeosystemphysiolo盯eharacteirstief(,rauthentieateanddisrirbure·Keywords:Anaeorbieammoniumox一dation.Planetomyeetes,Polyn一easreehian此aetion,Anamm(,xosome随着经济的迅猛发展,水体中的氮素污染日益严重,已经对环境造成了极大的影响。厌氧氨氧化(AnaeorbieAmmoniumoxidation,简称ANA-MMOX)是近几年内发展起来的高效生物脱氮技术,与传统的硝化反硝化脱氮工艺相比,它不需要外加有机碳源进行反硝化,污泥产量少;完全不需要氧气,节省了大量的运行费用;不需要酸碱中和剂,避免二次污染。厌氧氨氧化特别适合处理低C/N高氨氮废水,因此它已成为国内外生物脱氮研究的热点问题之一,而实际上对厌氧氨氧化菌微生物学的探讨较少,深人了解和研究厌氧氨氧化菌将有利于其技术应用于实际。1厌氧氨氧化的原理长期以来,人们认为氨的氧化只在有氧的条件下发生川。1977年Borda〔’j从化学热力学出发,’国家自然科学基金项目(No.5以78054)国际科技合作重点项目(N0.2侧只DFA06200)长沙市科技计划重点项日(No.Kos一32一72).’通讯作者eTl:0731一823967,E一mail:[e-mail]收稿日期:2侧沁刁2一15,修回日期:2以沁-06一14大胆地预言了厌氧氨氧化反应和厌氧氨氧化菌的存在。1995年,Mulder等[’〕在一个反硝化脱氮流化床反应器中发现了厌氧氨氧化作用,大量的NH犷和NO牙同时被去除,从而证实了Broda的预言。接着va。derGaaf等〔`{通过大量的实验研究发现,厌氧氨氧化是一个以氨氮为电子供体,亚硝酸氮为电子受体的自养生物脱氮反应(反应式1),轻氨和联氮是其中间产物,厌氧氨氧化菌的微生物学特征成为研究的热点。INH扩+l.32N0夕+O.o66HCO歹+O.13H十、1.oZN:+0.26N0-3+0.o66CHZOo.SN。,,+2.03HZo(l)2厌氧氨氧化菌的分离和鉴定2.1厌氧氨氧化菌的分离为了从富集培养物中分离厌氧氨氧化菌,先后采用系列稀释分离、平DOI:10.13344/j.microbiol.china.2007.01.0352的7年34(l)微生物学通报板划线分离、显微单细胞分离等多种方法,但均以失败告终。反复尝试失败后,终于采用密度梯度离心技术成功的纯化了厌氧氨氧化菌。这种方法的操作如下:首先,用超声波温和的破碎厌氧氨氧化菌富集培养物(生物膜或絮体),将菌群分散成单个菌体(细胞);接着,离心去除残留的聚集体(生物膜或絮体的碎片);最后,将分散的细胞进行ePrcon梯度密度离心。厌氧氨氧化菌沉淀于离心管下层,形成一个深红色的条带。经过优化后采用这种技术获得的细胞悬液可达到很高的纯度,每200一800个细胞中只含1个污染细胞[’丁。2.2厌氧氨氧化菌的鉴定2.2.1形态特征:tSrous等人从分离细胞浓缩液中检出了厌氧氨氧化活性,并据此判定这种细胞是厌氧氨氧化菌。电镜观察发现,在具有厌氧氨氧化活性的生物膜中,一种形态独特的细胞在数量上占据绝对优势。对这种细胞进行超薄切片观察,可发现细胞内存在分室[6}。至今为止,这种由细胞膜围成的分室结构只发现于planctomycetes(浮霉状菌目)的细胞中。进一步对这种细胞进行复染观察,可发现细胞表面均匀分布着火山口状的结构[“1。这种结构也只发现于planetomyeetes的细胞表面。这些形态特征都指向planetomyeetes,为厌氧氨氧化菌分类地位的最终确定提供了依据。2.2.2现代分子生物学技术鉴定:分子生物学技术是研究生态系统中微生物活性等的重要工具。从细胞悬液中提取DNA和RNA,直接用PcR扩增了165:DNA,同时也用165rDNA反向转录产生了erDNA(互补rDNA),以RT一PCR扩增了165CrD-NA。虽然细胞悬液的纯度高达99%以上,但只有从RT一PCR获得的克隆文库,序列种类相对集中(其中有个序列占80%)。根据这个优势序列,设计了18个特异性寡核昔酸探针,以Cy3荧光色素标记后,用于荧光原位杂交试验。在18个寡核什酸探针中,只有10个探针能与上述分离的厌氧氨氧化菌细胞结合。这些特异性寡核昔酸探针的获得,为厌氧氨氧化菌的鉴定提供了新的工具。为了确定分离细胞在细菌谱系中的身份,对其165rDNA进行序列(全长l,453bp,以E.eoil的编号方法,所测序列的位置为7一1,390)测定。所测的序列与数据库中其它细菌的165:DNA序列进行对比发现,厌氧氨氧化菌属于浮霉细菌(plancto-mycetes)。与之亲缘关系最近的序列是一个从海洋雪团状聚集物中扩增的165rDNA序列(同源性80.2%)。与其它浮霉细菌165:DNA序列的同源性为74%一77%。根据165rDNA谱系分析,目前确定了3种厌氧氨氧化菌,即Brcoadia包括B.an-am,xija。[7]和召roeaji。fugli而}8],`ue,nia包括尤:tut烤artiesnis[9],sealindua包括5.wagenri,5.borda。和5.、oorkiniil’o川(如图l所示)。scalind-ua、。orikini是在黑海的缺氧水域中被发现,这首次为厌氧氨氧化菌存在于大自然中提供了直接证据。图l厌氧氨氧化菌谱系树L’2}水平线表示165rRNA基因序列10%的差异..匕`-微生物学通报2(X)7年34(l)3厌氧氨氧化菌的生物化学特性3.1厌氧氮氧化体(ana~oxosome)厌氧氨氧化菌的细胞质被单层双分子膜分为三个独立的区域:①外层区域:Paryph叩lsam,外层被细胞壁和细胞膜所包围,内侧是胞质内膜;②irb叩lasm,包含内核;③内层自由核糖体区域,厌氧氨氧化体(anammoxosome),被厌氧氨氧化体膜所包围。厌氧氨氧化反应的一种重要的酶—联胺氧化酶(HZO),已被提纯,证明确实存在于厌氧氨氧化体中e[]。这就证明厌氧氨氧化分解代谢确实发生在厌氧氨氧化体内,厌氧氨氧化体是厌氧氨氧化菌中最为重要的细胞器。厌氧氨氧化体的相对体积很大,占整个细胞的30%一60%。eJettn等认为厌氧氨氧化体是一个多功能的细胞器,可能与细胞分裂、DNA复制以及其它生理活动有关。3.2厌氧氨氧化菌的生化反应模型氨和经胺在联胺水解酶(HH)的作用下生成联胺。联胺在联胺氧化酶(HZO)的作用下氧化。HZO在某些方面与亚硝化单胞菌的经胺氧化还原酶(HAO)有相似之处。厌氧氨氧化体中的联氨氧化生成氮气,并生成4个质子和4个电子。4个电子和irb叩lasm中的5个质子结合起来,在亚硝酸盐还原酶的作用下,可能把亚硝酸盐还原成经胺。在这个模型中,irb叩lasm层中有效的质子消耗和厌氧氨氧化体中电子的生成,使得厌氧氨氧化反应形成了质子梯度。这就形成从厌氧氨氧化体到irboplasm层的定向化学质子梯度。这个梯度包括化学电势能—化学质子梯度造成pH值的不同(乙pH),与厌氧氨氧化体比较,irboplasm层趋于碱性;还包括电位能—质子梯度造成电荷差异(乙平),与厌氧氨氧化体比较,irb叩lasm层趋于阴性。乙pH和乙平都对质子有一个驱动力—质子驱动力(乙p):使它从厌氧氨氧化体内进人体外。在川p的驱动下,厌氧氨氧化体膜中的ATP酶催化促进ATP的合成。质子通过ATP酶形成的小孔又进入irboplasm层中。ATP酶中球状的、亲水的那部分在irb叩lasm层,不亲水的那端在厌氧氨氧化体膜中。形成的ATp将在irboplasm层中被释放(如图2所示)。图2厌氧氨氧化菌的生化反应模型〔”]NIR(nit6te一喇ueingenzyme):亚硝酸盐还原酶,HH(hydarzinehydorlase):联胺水解酶,Hzo(hydrazine一oxidizingenzyme):联胺氧化酶3.3特征光谱在以无机盐培养基富集厌氧氨氧谱。随着富集培养物活性提高,468nm处的吸收峰化菌的过程中,富集培养物的颜色逐渐从黄棕色转逐渐增大。用CO处理富集物后,这个吸收峰消失,变为深红色,检测发现,厌氧氨氧化菌细胞色素。不能恢复。亚硝化单胞菌在463nm处也存在类似的的特征光谱(5O4nm一554nm,a一带明显加强)。但吸收峰,一般认为它与经胺氧还酶中的血红素有关,在77k处未检出细胞色素。(600nm一605nm,末端常称它为细胞色素编[’]。通过凝胶作用,已成功氧化酶的成分),b(554nm一5麟nm)和d,(662nm的从尺i记eninast砚gta此15015的细胞提取物中纯化得一665nm,cd:型亚硝酸盐还原酶的成分)的特征光到10kD细胞色素c[’`〕。2X()7年34(1)微生物学通报4厌氧氨氧化菌的生态生理学特性厌氧氨氧化菌是革兰氏阴性细菌,细胞单生或成对,出芽繁殖。它的细胞壁上有凹陷称之为“火山口状的结构”,细胞内部分区。厌氧氨氧化菌的脂质是醋连接和醚连接联合起来的脂肪酸。脂质是分类学的标志,它决定着膜的结构。很清楚地,脂肪膜使离子和代谢物产生浓度梯度。厌氧氨氧化菌具有各种特殊的膜脂质。厌氧氨氧化菌的脂质具有各种不同的种类和派生物。因此,厌氧氨氧化菌有各种独特的膜结构。它们含有一个,两个相同或两个不同的环状系统。厌氧氨氧化菌的膜脂质中还含有丰富的半环状系统。这种脂质占有Borcadiaanammoxidans中所有脂质的34%。这种环状膜脂质的结构在自然界中是比较独特的。而且至今为止这种环状膜脂质的结构也只在厌氧氨氧化菌中才被发现。这种膜脂质结构的功能意义引起了广泛的关注。在发现的厌氧氨氧化菌中,B.anammoxidans和K.stutz邵rtieois研究得比较多。B.anammoxi-da。有一层蛋自质的细胞壁,但细胞壁里缺乏肤聚