BAC滤池应对小分子醛类污染物过程中生物菌落特性变化分析

CITYANDTOWNWATERSUPPLY·水质分析与监测·城镇供水NO.6201435甲醛、乙醛以及丙烯醛等小分子醛类污染物通常易溶于水且很难被传统净水工艺去除，对饮水安全存在潜在的风险[1]。此前张春雷等人[2]的试验发现生物活性炭滤池对此类小分子醛类污染物具有较好的降解作用，但在用炭滤池需要4~30h的驯化或适应时间。但文中并未阐述这一过程中微生物菌群的特征和变化。因此，了解微生物菌落的这一变化过程及其背后机理有助于这一过程的研究和该技术的实际应用。16SrDNA克隆文库技术是当前研究各种环境微生物群落结构及其多样性研究的主要技术手段[3,4]。本试验构建了BAC滤池处理含小分子醛类水样前后活性炭滤池中细菌的16SrDNA克隆文库，并通过16SrDNA序列的系统发育分析,探讨了过程前后活性炭滤池微生物多样性的变化，并通过HPC分析比较了前后生物量的差异，对降解小分子醛类污染物的主要菌群进行了分析和探索。1.材料和方法1.1化学试剂和设备Tryptone1.0g/L，EGTA10-3mol/L，Tris缓冲溶液0.01mol/L，Zwittergent3~122×10-4mol/L，R2A培养基。1.2分析方法和试验条件微生物量的测定采取HPC法[5]。细菌多样性分析过程包括：活性炭炭表面细菌总DNA提取，16SrDNA基因全长的PCR扩增，16SrDNA基因文库的构建，基因文库的ARDRA分型以及序列测定和系统发育分析。方法参见郝春博等人的研究[6]。其他水质参数分析参见《生活饮用水标准检测方法》GB/T5750-2006。水厂在用颗粒活性炭(SC)取自北方J水厂二期2A8炭池，宁夏太西活性炭厂生产，炭龄25个月。试验室活性炭滤柱直径60mm，玻璃材质。运行参数参考J水厂实际工艺，填装活性炭SC。进水中添加0.8~2.4mg/L乙醛，0.5~1.0mg/L丙烯醛。运行至出水中乙醛与丙烯醛浓度稳定取炭样（SY）进行分析。2.试验结果2.1HPC检测结果结果如表1，图1-1.1-2所示。BAC滤池应对小分子醛类污染物过程中生物菌落特性变化分析张春雷　许　光　冯博然　郑　鹏（北京市自来水集团有限责任公司，北京100031）摘要：本文在实验室条件下提取BAC滤池处理乙醛、丙烯醛等小分子醛类污染物前（SC）后（SY）活性炭表面微生物总DNA，构建16S…rDNA克隆文库，并通过16S…rDNA序列的系统发育分析，对样品中细菌种群多样性及群落结构的前后变化进行了分析。结果表明BAC滤池处理乙醛和丙烯醛前后细菌种群和菌落结构发生了显著变化。SC样品文库中阳性克隆的16S…rDNA序列分属13个细菌类群，…Alphaproteobacteria（25%）、Acidobacteria（15%）、Planctomycetes（12%）、Betaproteobacteria（11%）、Nitrospira（6%）是其中可辨识的最大几个类群，HPC量为1.18×107…CFU/g；而SY样品阳性克隆的16S…rDNA序列分属6个细菌类群，分别为Alphaproteobacteria（10%）、Betaproteobacteria（78%）、…Gammaproteobacteria（5%）、Deltaproteobacteria（5%）、Acidobacteria（1%）、Unidentified…bacteria（1%），HPC量增加到了1.28×108…CFU/g。SY样品文库中与已培养种或克隆相似度较高的种群数为33种，远低于SC样品的81种，且主要菌群丰度增高显著。SY文库中属于Betaproteobacteria类群的SY-10.SY-41.SY-1.SY-75.SY-14.SY-107超过总基因库频率的50%，对乙醛和丙烯醛等小分子醛类的降解起决定性作用。关键词：乙醛　丙烯醛　生物活性炭（BAC）　异养菌总数计数（HPC）　16SrDNA…DOI:10.14143/j.cnki.czgs.2014.06.013CITYANDTOWNWATERSUPPLY·水质分析与监测·36城镇供水NO.62014图1-1SC样品超声洗脱水样稀释1000倍菌落形态图1-2SY样品超声洗脱水样稀释10000倍菌落形态2.2微生物多样性及系统发育学分析结果将从SC、SY样品中得到的每种基因型的序列输入RDP网站，利用Classifier程序确定其系统发育类群。结果分别如图2-1，2-2所示，两者细菌种群结构差异显著。图2-1　SC样品中各类细菌在文库中所占比例图2-2　SY样品中各类细菌在文库中所占比例其中，SC样品结果显示，文库中细菌克隆的16SrDNA序列分属13个细菌类群（如图2-1），分别为Alphaproteobacteria（25%）、Betaproteobacteria（11%）、Gammaproteobacteria（4%）、Deltaproteobacteria（2%）、unclassified_Proteobacteria（3%）、Acidobacteria（15%）、Verrucomicrobia（4%）、Planctomycetes（12%）、unclassifiedbacteria（11%）、Nitrospira（6%）、Gemmatimonadetes（2%）、Bacteroidetes（3%）、Actinobacteria（2%）。而SY样品结果则显示文库中细菌克隆的16SrDNA序列分属6个细菌类群（如图1），分别为Alphaproteobacteria（10%）、Betaproteobacteria（78%）、Gammaproteobacteria（5%）、Deltaproteobacteria（5%）、Acidobacteria（1%）、Unidentifiedbacteria（1%）。相对于SC样品，SY样品中细菌类群减少7个。其中在SC样品中占相当比重（55%）的Acidobacteria（15%）、Verrucomicrobia（4%）、Planctomycetes（12%）、unclassifiedbacteria（11%）、Nitrospira（6%）、Gemmatimonadetes（2%）、Bacteroidetes（3%）、Actinobacteria（2%）均未检出。Alphaproteobacteria的比重也由25%下降至10%。与之形成鲜明对比的是Betaproteobacteria的比重从SC样品的11%激增到78%，增加6倍有余；此外Deltaproteobacteria也从2%增加到5%，增加1.5倍。细菌类群的改变和集中凸现了外界因素（乙醛和丙烯醛）对自然状态下炭滤池菌群的干扰和影响。为了进一步了解两个样品表面菌群的系统发育地位，本研究还将每种基因型的序列输入NCBI网站，用BLAST程序与数据库中已有的序列进行比对分析，并将下载相似性最高的序列和相似性较高的已知种的序列作为参考。将所有序列用BioEdit中ClustalW程序比对后，用MEGA4.0软件绘制系统发育树（SC炭表1　活性炭滤床中HPC计数检测结果含水率/%湿碳菌量/CFU·g-1干碳菌量/CFU·g-1SC60.754.64×1061.18×107SY56.755.56×1071.28×108CITYANDTOWNWATERSUPPLY·水质分析与监测·城镇供水NO.6201437样图3-1-1，3-1-2，SY炭样图3-2-1，3-2-2）。3.讨论3.1HPC结果分析SY样品中微生物的量增加明显，从1.18×107CFU/g增加到1.28×108CFU/g，单位质量活性炭表面HPC的量比原炭SC高了一个数量级。而且从菌落形图3-1-1　SC样品中菌落基于16SrDNA序列的Proteobacteria细菌系统发育树CITYANDTOWNWATERSUPPLY·水质分析与监测·38城镇供水NO.62014图3-1-2SC样品中菌落基于16SrDNA序列的其它门的细菌系统发育树CITYANDTOWNWATERSUPPLY·水质分析与监测·城镇供水NO.6201439图3-2-1　SY样品中菌落基于16SrDNA序列的Proteobacteria细菌系统发育树图3-2-2　SY样品中菌落基于16SrDNA序列的其它门的细菌系统发育树CITYANDTOWNWATERSUPPLY·水质分析与监测·40城镇供水NO.62014态上看，也有较大差异。SY炭中的细菌生长速度很快，3天时间菌落即清晰可见，而SC样品中的细菌长到第七天大多数菌落仍然较小（如图1-1，1-2）。原因可能是J水厂炭滤池进水中的有机碳含量较少，炭滤池中的微生物大都是典型的寡营养型细菌[7]，所以生长较慢。SY样品进水中由于添加了乙醛和丙烯醛两种可被降解的有机物，有机碳含量较高，炭表面的降解菌代谢速度较快，适合在检测所用培养基上生长，所以生长速度更快。从形态上看，SC样品中的菌落较小，大多为白色，同时还有2~3种一定数量的黄色菌落。SY样品中除了这些细菌之外，还有许多大型及中型的白色菌落，以及少数土黄色的菌落。这些细菌是进水投加了乙醛、丙烯醛之后，活性炭中细菌菌群发生改变而产生的，因此可能是起降解作用的细菌。另外，SY样品中的黄色细菌的比例也有所减少。3.2SC样品基因文库及发育系统分析SC样品中相似度较高的种群共81种，其中α-Proteobacteria（α-变形杆菌纲）的细菌在文库中所占比例达25%，检出的相似度较高的种群共23种，是第一大类群。该类群细菌绝大多数是寡营养类型[8]，揭示了自然条件下SC炭池进水中可生物降解有机碳极少。而在SY样品中Alphaproteobacteria的比重下降至10%，是第二大类群，且种群的数量仅有7种，种群间的丰度也有所降低。SC样品中Betaproteobacteria类群检出相似度较高的种群共8种，丰度较高的SC-8和SC-56分别为4.10%和2.46%；而在SY样品中Betaproteobacteria类群检出相似度较高的种群共21种，占到整个文库检出种群总数（33种）的67.7%，其中SY-10，SY-1，SY-29，SY-14的基因频数分别占总基因文库的21%，19%，9%和8%，种群丰度明显增加，外界干扰（乙醛，丙烯醛）迹象明显。SC样品中微生物的种群数量（88种）明显高于SY样品（33种），且所有种群的丰度均处于较低水平，反映了自然条件下寡养环境菌群的稳定性。其中与已知培养种群近似度较高的种群极少。SC-46与Acidobacteriumsp.（酸杆菌属）的相似度为98%，丰度为2.46%。除此以外，SC-68与Hyphomicrobiumsp.（丝微菌属）细菌聚在一个分枝上，HyphomicrobiumTH205具有反硝化酶系与固氮酶系[9]，且能利用甲醇为唯一碳源快速生长[10，11]。SC-59与Terrimonassp.是鞘脂杆菌目泉发菌科（Crenotrichaceae）的一个属，在降解甲基叔丁基醚（MTBE）的培养物中占很大比例[12]。以上几个种群可以利用的有机碳能源如甲基硫化物或甲基叔丁基醚在炭池进水中均未检出，其来源可能是其它微生物的代谢产物，这也从侧面反映了SC样品中微生物种群多样和共生的关系。其它相似度较高的包括：SC-10.SC-34为Nitrospirasp.（硝化螺旋菌属），与已知序列相似性都为97%，Nitrospira占整个克隆文库的6%。Nitrospira可将亚硝酸盐氧化成硝酸盐，为化能无机自养型，是真正起亚硝酸盐氧化作用的菌属[13，14]。，SC-43.SC-61与UnculturedPirellulasp.clone（小梨形菌属）的序列有99％的相似性，Pirellulasp.属于Planctomycetes（浮霉菌门），有些菌株在无氧的条件下能够还原硝酸盐。这些菌属的确认同样证明了SC炭池进水中有机质极少，依靠“三氮”转化获取能量的细菌也占