CN2017110168905一种多聚磷酸盐激酶基因及在污水除磷中的应用公开号10774685

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号(43)申请公布日(21)申请号201711016890.5(22)申请日2017.10.26(71)申请人海南师范大学地址571158海南省海口市龙昆南路99号(72)发明人王锐萍　张文飞　伍思宇　张起畅　殷浩能　吴红萍　金映虹　(74)专利代理机构北京中济纬天专利代理有限公司11429代理人于跃(51)Int.Cl.C12N15/54(2006.01)C12N9/12(2006.01)C12N1/21(2006.01)C02F3/34(2006.01)C02F101/10(2006.01)(54)发明名称一种多聚磷酸盐激酶基因及在污水除磷中的应用(57)摘要本发明涉及一种多聚磷酸盐激酶基因及在污水除磷中的应用，具体涉及三个新型多聚磷酸盐激酶基因ppk33、ppk44、ppk73，分别具有如SEQ NO 1、SEQ NO 2和SEQ NO 3所示的核苷酸序列。本发明所述多聚磷酸盐激酶基因ppk33、ppk44、ppk73制备的工程菌，可用于去除污水中的磷元素，其中菌株M15/pQE30a-ppk44T是其对应对照菌株去磷量的7倍，10h聚磷率高达70％。权利要求书1页说明书9页序列表11页附图2页CN107746850A2018.03.02CN107746850A1.三个新型多聚磷酸盐激酶基因ppk33、ppk44、ppk73，其特征在于ppk33、ppk44、ppk73的DNA序列分别具有如SEQ NO 1、SEQ NO 2和SEQ NO 3所示的核苷酸序列。2.三个蛋白质的氨基酸序列，其特征在于所述氨基酸序列分别具有如SEQ NO 4、SEQ NO 5、SEQ NO 6所示的氨基酸序列。3.权利要求2所述的三个蛋白质的氨基酸序列，其特征在于分别由SEQ NO 1、SEQ NO 2和SEQ NO 3所示的核苷酸序列编码。4.三个新型多聚磷酸盐激酶基因ppk33、ppk44、ppk73的方法，其特征在于所述方法包括如下步骤：以菌株Acinetobacter.tandoii SC36基因组为模板，利用PCR的方法获得完整的基因片段ppk33、ppk44和ppk73。5.权利要求4所述的方法，其特征在于PCR使用的引物与限制性内切酶如下：ppk33引物F:CCATGGAAAATTTTCAACATTCATC，限制性内切酶Nco ⅠR:GCTCGAGGATTTTCTGTAGACTCTTGTTCATC，限制性内切酶Xho Ⅰppk44引物F:TGGATCCATGAATACGGCGGCACAGA，限制性内切酶BamH ⅠR:TGTCGACTTATTTAATCATTTCCAACAAAGTC，限制性内切酶Sal Ⅰppk73引物F:TGGATCCTTGTCAATTTTAGATTTTAATTTACG，限制性内切酶BamH ⅠR:TCTGCAGTTACTTTATAACGCTTAACAAAAAG，限制性内切酶Pst Ⅰ。6.权利要求5中所述的引物在制备多聚磷酸盐激酶基因ppk33、ppk44、ppk73中的应用。7.三种工程菌，其特征在于所述工程菌分别为BL21(DE3)/pET28a-ppk33T、M15/pQE30a-ppk73T、M15/pQE30a-ppk44T。8.权利要求7所述的三种工程菌在污水除磷中的应用。9.三个新型多聚磷酸盐激酶基因ppk33、ppk44、ppk73在制备工程菌BL21(DE3)/pET28a-ppk33T、M15/pQE30a-ppk73T、M15/pQE30a-ppk44T中的应用。权　利　要　求　书1/1页2CN107746850A2一种多聚磷酸盐激酶基因及在污水除磷中的应用技术领域[0001]本发明属于基因工程领域，具体涉及一种多聚磷酸盐激酶基因及在污水除磷中的应用。背景技术[0002]水体富营养化已成为全球问题且日趋恶化，近年来，大量的氮、磷、钾等元素被排入各种水体的速度远远超过其被消耗速度，水体的有机物不断积累，水生生态平衡被打破，水体富营养化已成为全球问题并日趋恶化(Yang X.E,Wu X.,Hao H.L.,He Z.l.Mechanisms and assessment of water eutrophication[J].Journal of Zhejiang University B,2008,3(3):197-209)。在所有的营养元素中，磷对藻类生长尤为重要，以磷为限制因子，当总磷浓度超过0.1mg/L，藻类就会过度繁殖(林晓,刘蜻,徐厚坤.富营养化水体中磷的控制方法初探[J].城镇供水, 2003,2(1):29-30；Abell J.M.,D.,Hamilton D.P.Nitrogen and phosphorus limitation of phytoplankton growth in New Zealand lakes:implicatios for eutrophication control[J].Ecosystems, 2010,13(7):966-977)。然而，无限制排放的磷进入水体生态系统后，还会发生复杂的吸附、固定和再释放过程，使污染水体更加难以治理(郑金伟,冉炜,钟增涛,何健.增强型生物除磷过程中聚磷酸盐积累微生物的研究进展[J].应用生态学报,2004,15(8),1487-1490)。磷是引起水体富营养化的重要因素，除去水体中积聚的磷是水体修复中亟待解决的关键问题。[0003]聚磷菌的发现为解决水体中无机磷的富集问题起到了至关重要的作用，国内外学者相继筛选了很多具有聚磷能力的微生物，一般都是从高度富营养化水体的沉积物或活性淤泥中筛选得到，蔡天明等从城市污水处理厂好氧池活性污泥中分离获得一株Pseudomonas grimontii C18，在好氧培养24h后除磷率达94.1％(蔡天明,陈立伟,吴守中,钱丽花,任倩.1株脱氮除磷菌的筛选及其特性研究[J].环境科学,2010,31(10):2487-2492)。庄志刚等从福州市闽侯县上街镇高岐村某排污口淤泥中分离出1株高效聚磷菌—Alcaligenes sp.ZGED-12，经优化培养条件后对磷的去除能力可达80％(庄志刚,韩永和,章文贤,周志华,陈佳兴,李敏.高效聚磷菌Alcaligenes sp.ED-12菌株的分离鉴定及其除磷特性[J].环境科学学报,2014,34(3): 678-687)。但是目前对红树林土壤聚磷菌的研究鲜见报道，红树林为潮滩湿地生物群落，长期遭受海水周期性浸淹，其生态环境与聚磷菌的聚磷过程好氧-厌氧交替环境高度一致，蕴藏着丰富的聚磷微生物资源。本申请发明人随机采集了东寨港红树林134份土壤样品，总共获得185株初筛菌株，有42株菌株的聚磷能力达到20％以上，其中Acinetobacter.tandoii SC36 最高聚磷率可达到70％，这些菌株可为富营养化水体的快速、高效处理提供了有效的菌种资源。发明内容[0004]本发明中聚磷菌株Acinetobacter.tandoii SC36的16S rRNA基因序列已由发明人提交到 GenBank数据中，其序列号为KU353550(GenBank:KU353550.1)。说　明　书1/9页3CN107746850A3[0005]本发明提供三个新型多聚磷酸盐激酶基因ppk33、ppk44、ppk73，其特征在于ppk33、ppk44、 ppk73的DNA序列分别具有如SEQ NO 1、SEQ NO 2和SEQ NO 3所示的核苷酸序列。[0006]本发明的另一实施方案提供三个蛋白质的氨基酸序列，其特征在于所述氨基酸序列分别具有如SEQ NO 4、SEQ NO 5、SEQ NO 6所示的氨基酸序列；所述氨基酸序列依次由SEQ NO 1、SEQ NO 2和SEQ NO 3编码。[0007]本发明的另一实施方案提供一种制备上述三个新型多聚磷酸盐激酶基因ppk33、ppk44、 ppk73的方法，其特征在于所述方法包括如下步骤：[0008]以菌株Acinetobacter.tandoii SC36基因组为模板，利用PCR的方法获得完整的基因片段 ppk33、ppk44和ppk73。[0009]上述PCR使用的引物与限制性内切酶如下：[0010]ppk33引物F:CCATGGAAAATTTTCAACATTCATC，限制性内切酶NcoⅠ[0011]R:GCTCGAGGATTTTCTGTAGACTCTTGTTCATC，限制性内切酶XhoⅠ[0012]ppk44引物F:TGGATCCATGAATACGGCGGCACAGA，限制性内切酶BamHⅠ[0013]R:TGTCGACTTATTTAATCATTTCCAACAAAGTC，限制性内切酶SalⅠ[0014]ppk73引物F:TGGATCCTTGTCAATTTTAGATTTTAATTTACG，限制性内切酶BamHⅠ[0015]R:TCTGCAGTTACTTTATAACGCTTAACAAAAAG，限制性内切酶PstⅠ[0016]本发明的另一实施方案提供如下一对引物在制备多聚磷酸盐激酶基因ppk33中的应用，其特征在于所述引物如下：[0017]F:CCATGGAAAATTTTCAACATTCATC[0018]R:GCTCGAGGATTTTCTGTAGACTCTTGTTCATC。[0019]本发明的另一实施方案提供如下一对引物在制备多聚磷酸盐激酶基因ppk44中的应用，其特征在于所述引物如下：[0020]F:TGGATCCATGAATACGGCGGCACAGA[0021]R:TGTCGACTTATTTAATCATTTCCAACAAAGTC。[0022]本发明的另一实施方案提供如下一对引物在制备多聚磷酸盐激酶基因ppk73中的应用，其特征在于所述引物如下：[0023]F:TGGATCCTTGTCAATTTTAGATTTTAATTTACG[0024]R:TCTGCAGTTACTTTATAACGCTTAACAAAAAG。[0025]本发明的另一实施方案提供三种大肠杆菌工程菌，其特征在于所述工程菌分别为 BL21(DE3)/pET28a-ppk33T、M15/pQE30a-ppk73T、M15/pQE30a-ppk44T。[0026]本发明的另一实施方案提供上述三种工程菌在污水除磷中的应用。[0027]本发明的另一实施方案提供上述三个新型多聚磷酸盐激酶基因ppk33、ppk44、ppk73在制备上述工程菌BL21(DE3)/pET28a-ppk33T、M15/pQE30a-ppk73T、M15/pQE30a-ppk44T中的应用。[0028]本发明的大概方案如下：[0029]为进一步解析菌株SC36的除磷机制，采用Illumina Hiseq 2000测序技术完成高效聚磷菌株Acinetobacter.tandoii SC36的基因组扫描测序，构建300bp文库，利用SOAPdenovo v2.04 拼接软件对优化序列进行多个Kmer参数的拼接，得到最优的组装结果说　明　书2/9页4CN107746850A4后，再运用GapCloser v1.12软件对组装结果进行局部内洞填充和碱基校正。依据拼接序列的总长、scaffold的数量以及scaffold N50等技术指标，对多个Kmer的组装结果进行综合评定，最终SC36基因组测序分析获得了56个scaffold，GC含量为41.98％。[0030]利用Glimmer 3.02软件进行细菌的基因预测，将预测基因的蛋白序列分别与Nr、genes、 string和GO数据库进行blastp比对(BLAST 2.2.28+)，鉴定菌株SC36含有3个ppk基因，命名为ppk33(SEQ NO 1)、ppk44(SEQ NO 2)和ppk73(SEQ NO 3)，开放阅读框(ORF) 大小分别为2061bp、2082bp和2010bp，分别编码686(SEQ NO 4)、693(SEQ