搜索
(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号(43)申请公布日(21)申请号201711484461.0(22)申请日2017.12.29(83)生物保藏信息CCTCCM20175402017.09.25(71)申请人浙江双良商达环保有限公司地址310000浙江省杭州市西湖区翠苑街道文二路164号杭州商学院内(72)发明人郑展望 潘碧文 崔志文 谢柳 金鹏 (74)专利代理机构杭州知通专利代理事务所(普通合伙)33221代理人朱林军(51)Int.Cl.C12N1/20(2006.01)C12N1/02(2006.01)C12Q1/04(2006.01)C02F3/34(2006.01)C12R1/01(2006.01)C02F101/10(2006.01)(54)发明名称不动杆菌CL05及其在村镇污水除磷处理中的应用(57)摘要本发明提供了一株不动杆菌CL05Acinetobacter sp.CL05及其该菌株应用。本发明的菌株高效聚磷并使之成为污水处理设备中的优势菌，大量吸收污水中的磷，在体内形成多聚磷酸盐，通过排出菌泥沉淀达到除磷目的。该菌株能很好地融入到当前常用的生物法污水处理工艺当中去，不但能用于村镇、城市生活污水中，还适用于河道、商业和工业等方面的污水和废水，并且无需改动或者改造成本很低，在污水处理设备(例如村镇污水净化槽、城市污水处理厂等)中除磷将具有广泛的应用价值。权利要求书1页说明书6页序列表1页附图1页CN108359617A2018.08.03CN108359617A1.不动杆菌CL05Acinetobacter sp.CL05，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC M 2017540。2.一种如权利要求1所述的不动杆菌CL05Acinetobacter sp.CL05在污水除磷处理中的应用。3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，不动杆菌CL05Acinetobacter sp.CL05在污水除磷处理中，污水的pH值调为6.0-8.0。4.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述应用包括在村镇、城市生活污水的治理及河道、商业和工业方面污水和废水的治理。5.一种如权利要求1所述的不动杆菌CL05Acinetobacter sp.CL05的筛选方法，其特征在于，所述筛选方法包括以下步骤：步骤a，富集培养：从河道淤泥中提取淤泥样品，加入LB液体培养基，培养一段时间后加入富集培养基中进行富集培养；步骤b，纯化：富集完成后将富集菌液梯度稀释至合适浓度涂布在LB平板，37℃培养12～24h；步骤c，粗筛：根据聚磷菌在好氧条件下会吸收磷形成多聚磷酸盐颗粒的特性，进行异染染色；挑单菌落进行异染染色，镜检选出了有异染颗粒的单菌落；步骤d，复筛：将粗筛过的菌株接种至复筛培养基，检测总磷，对比除磷率，除磷率最高的命名为CL05。6.根据权利要求4所述的不动杆菌CL05Acinetobacter sp.CL05的筛选方法，其特征在于，富集培养基的成分为1000ml水中，乙酸钠5.0g，七水合硫酸镁0.5g，氯化钙0.2g，硫酸铵2.0g，磷酸二氢钾分别为10mg、20mg、30mg、40mg，pH值7.2，121℃灭菌湿热灭菌20min。权 利 要 求 书1/1页2CN108359617A2不动杆菌CL05及其在村镇污水除磷处理中的应用技术领域[0001]本发明涉及一株新的菌种——不动杆菌CL05Acinetobacter sp.CL05，及利用该菌株去除污水中磷的应用。背景技术[0002]前污水处理中磷的处理主要有化学絮凝沉淀法除磷和微生物法除磷，微生物法除磷具有安全无毒，低成本，经济实用。化学法主要是加入铝盐、铁盐跟磷生产难溶沉淀，而微生物法主要是利于微生物吸收污水中的磷，通过排出菌泥沉淀达到除磷的效果。[0003]然而普通污水处理设备中聚磷菌的含量过低以及聚磷效果很差，不能有效繁殖成优势菌以及高效吸收污水溶液中的磷，出水磷严重超标。发明内容[0004]本发明为了克服现有技术的至少一个不足，提供一株新的菌种——不动杆菌CL05Acinetobacter sp.CL05，及利用该菌株在污水中除磷的方法。[0005]为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：[0006]不动杆菌CL05(Acinetobacter sp.CL05)，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉武汉大学，保藏编号CCTCC NO:M 2017540，保藏日期2017年09月25日。[0007]该新菌株特征如下：[0008]菌落形态：30℃在LB平板培养12h，菌落形态为淡黄色、不透明菌落，呈中间隆起光滑圆形，且表明湿润有光泽等性质。直径2～3mm，菌落随时间的延长而增大，数天后直径可达4mm以上，且颜色变深。[0009]细胞形态：16h培养物的细胞呈棒状杆菌，无端生鞭毛，亦无荚膜和芽孢结构，直径0.3-1.0μm。甲苯胺蓝染色油镜下胞内明显可见PHB异染颗粒。[0010]生理生化特征：革兰氏阴性，兼性厌氧，化能异养，最适生长温度为30℃。甲基红实验阴性、过氧化氢酶阳性、吲哚实验阴性、精氨酸双水解酶实验阳性、VP实验阴性、淀粉水解实验阴性、硝酸盐还原实验阳性、乳糖氧化发酵阴性、明胶液化实验阳性。利用细菌16S rDNA序列测序的方法对其进行种属鉴定，序列见核酸序列表SEQ ID NO:1。[0011]本发明还提供上述不动杆菌CL05Acinetobacter sp.CL05在污水除磷处理中的应用。[0012]优选的，不动杆菌CL05Acinetobacter sp.CL05在污水除磷处理中，污水的pH值调为6.0-8.0。[0013]此外，本发明还提供上述的不动杆菌CL05Acinetobacter sp.CL05的筛选方法，包括以下步骤：[0014]步骤a，富集培养：从河道淤泥中提取淤泥样品，加入LB液体培养基，培养一段时间后加入富集培养基中进行富集培养；[0015]步骤b，纯化：富集完成后将富集菌液梯度稀释至合适浓度涂布在LB平板，37℃培说 明 书1/6页3CN108359617A3养12～24h；[0016]步骤c，粗筛：根据聚磷菌在好氧条件下会吸收磷形成多聚磷酸盐颗粒的特性，进行异染染色；挑单菌落进行异染染色，镜检选出了有异染颗粒的单菌落；[0017]步骤d，复筛：将粗筛过的菌株接种至复筛培养基，检测总磷，对比除磷率，除磷率最高的命名为CL05。[0018]进一步，富集培养基的成分为1000ml水中，乙酸钠5.0g，七水合硫酸镁0.5g，氯化钙0.2g，硫酸铵2.0g，磷酸二氢钾分别为10mg、20mg、30mg、40mg，pH值7.2，121℃灭菌湿热灭菌20min。[0019]本发明的有益效果主要体现在：本发明筛选了一株高效聚磷并使之成为污水处理设备中的优势菌，大量吸收污水中的磷，在体内形成多聚磷酸盐，通过排出菌泥沉淀达到除磷目的。应用本发明的聚磷菌能够大量将污水中的磷转化为胞内的多聚磷酸盐，可以通过排污泥的形式达到高效的除磷效果。[0020]该菌株不但应用于村镇、城市生活污水的治理，还适用于河道、商业和工业等方面污水和废水的治理。[0021]为让本发明的上述和其它目的、特征和优点能更明显易懂，下文特举较佳实施例，作详细说明如下。附图说明[0022]图1为实施例1中Acinetobacter sp.CL05的生长和聚磷曲线。具体实施方式[0023]下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：[0024]实施例1[0025]1.聚磷菌的筛选[0026]1.1取样：取浙江农林大学东湖校区河道淤泥5g。[0027]1.2富集培养：将样品加入100mlLB液体培养基，37℃、200rpm摇床振荡60min。取振荡后的样品10ml加入100ml富集培养基，先接入含磷酸二氢钾浓度最低的富集培养基，37℃、200rpm摇床培养3天，培养结束后转接入磷酸二氢钾浓度更高的富集培养基按上述条件继续培养，依次进行富集直至4个浓度富集培养基都培养完成。[0028]1.3纯化：富集完成后将富集菌液梯度稀释至合适浓度涂布在LB平板，37℃培养12～24h。[0029]1.4粗筛：根据聚磷菌在好氧条件下会吸收磷形成多聚磷酸盐颗粒的特性，进行异染染色。挑单菌落共计58个进行异染染色，镜检选出了有异染颗粒的4个单菌落。[0030]1.5复筛：将粗筛过的菌株接种至复筛培养基，检测总磷，对比除磷率。[0031]将目前筛选的4株聚磷菌接入装有5mlLB液体培养基的试管，30℃、200rpm培养24h。[0032]将上述培养液按千分之一的接种量接入200ml未经灭菌处理的浙江农林大学农村生环境研究所实训基地生活污水，30℃、200rpm培养2天，分别于0h、24h、48h取样，离心取上说 明 书2/6页4CN108359617A4清液，测总磷含量。实验结果如表1所示。[0033]表1复筛时不同菌株的磷去除率比较。[0034][0035]选出24h总磷去除率最高的3号初筛菌，作为复筛出的最佳聚磷菌，制作成25％甘油管-80℃冷藏，编号为CL05。[0036]其中所述富集培养基按下述比例配制：1000ml水中，乙酸钠5.0g，七水合硫酸镁0.5g，氯化钙0.2g，硫酸铵2.0g，磷酸二氢钾分别为10mg、20mg、30mg、40mg，PH值7.2，121℃灭菌湿热灭菌20min。[0037]所述LB液体培养基按下述比例配制：1000ml水中，蛋白胨10.0g，酵母粉5.0g，NaCl 10.0g，pH 7.2，121℃湿热灭菌20min。[0038]所述LB固体培养基在LB液体培养基的基础上加入2％(w/v)的琼脂。[0039]所述异染染色剂为：甲液：甲苯胺蓝0.15g，孔雀绿0.2g，冰醋酸1ml，乙醇(95％)2ml，蒸馏水100ml。乙液：碘2g，碘化钾3g，蒸馏水300ml。[0040]所述异染染色方法为方法：按常规方法制片，用甲液染色5min，倾掉甲液，用乙液冲去甲液，并染色1min，水洗，吸干，备油镜镜检。异染颗粒呈黑色，菌体其他部分呈绿色。[0041]所述总磷检测按GB/T 11893-1989《水质总磷的测定钼酸铵分光光度法》进行。[0042]2、菌种鉴定[0043]对所筛选出来的CL05号菌进行16SrDNA测序[0044]方法：提取细菌基因组DNA，设计引物27F：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’，1492R：5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’，RCR条件为：94℃预变性5min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸2min，30循环，72℃延伸10min，12℃保温。[0045]测序结果如SEQ ID No.1所示。[0046]测序结果与NIBC数据库进行对比，与不动杆菌属(Acinetobacter sp.)的关系最近，有98％的同源度，系统发育进化分析也表明该菌株属于不动杆菌属，命名为不动杆菌CL05(Acinetobacter sp.CL05)。[0047]3、聚磷菌生长和聚磷曲线测定[0048]3.1将聚磷效果最好的不动杆菌CL05接入100mlLB培养基，37℃，200rpm培养12h。[0049]3.2取上述培养基按10％体积比接入检测培养基，分别在0h，2h，4h，8h，10h，12h，14h、16h、18h、20h、22h、24h，26h、28h测培养基和上清液的总磷含量，测600nm下吸光度值，说 明 书3/6页5CN108359617A5数据如表2所示。[0050]其中所述检测培养基按下述比例配制：1000ml水中，蛋白胨10.0g，酵母粉1.0g，NaCl 10.0g，pH 7.0，121℃湿热灭菌20min。[0051]表2不同培养时间培养基和上清液的总磷含量[0052][0053][0054]根据上表绘制Acinetobacter sp.CL05生长和聚磷曲线，得到图1。[0055]4、最适pH值实