Cu对厌氧发酵中水解酶活性及沼气产量的影响

第28卷第9期农业工程学报Vol.28No.92022012年5月TransactionsoftheChineseSocietyofAgriculturalEngineeringMay2012Cu对厌氧发酵中水解酶活性及沼气产量的影响陈琳1，谷洁2,3※，高华2,3，秦清军2,3，王小娟2,3，陈智学1（1.西北农林科技大学理学院，杨凌712100；2.西北农林科技大学资源环境学院，杨凌712100；3.陕西省循环农业工程技术研究中心，杨凌712100）摘要：为了探讨重金属Cu对厌氧发酵产沼气的影响机制，在中温条件下（37℃），研究了猪粪中Cu含量（以干猪粪的质量分数计）对厌氧发酵过程中水解酶活性及产气进程的影响。结果表明：整个发酵过程中CK处理（Cu质量分数49.70mg/kg）的纤维素酶活性及蔗糖酶活性显著高于H处理（Cu质量分数949.70mg/kg），CK、L（Cu质量分数349.70mg/kg）处理的脲酶活性显著高于M（Cu质量分数649.70mg/kg）、H处理（p0.05）。H处理对原料的产沼气进程有明显的抑制作用，日产气量在消化的前34d一直低于CK、L、M处理，CK处理总产气量比H处理高9%。相关性分析表明，CK处理的3种水解酶活性、L处理的脲酶活性、M处理的蔗糖酶活性均与产气速率呈显著正相关（p0.05），而H处理这种关系不明显，表明外源Cu可能通过影响微生物活性等多方面因素对产气速率造成综合影响，导致水解酶活性与产气速率相关性不显著。该文研究结果可为提高厌氧发酵产气效率，实现畜禽粪便资源高效利用提供参考。关键词：沼气，发酵，Cu，水解酶活性doi：10.3969/j.issn.1002-6819.2012.09.034中图分类号：TK6文献标志码：A文章编号：1002-6819(2012)-09-0202-06陈琳，谷洁，高华，等.Cu对厌氧发酵中水解酶活性及沼气产量的影响[J].农业工程学报，2012，28(9)：202－207.ChenLin,GuJie,GaoHua,etal.EffectsofCuonhydrolyticenzymeactivitiesandbiogasproductionduringanaerobicfermentation[J].TransactionsoftheChineseSocietyofAgriculturalEngineering(TransactionsoftheCSAE),2012,28(9):202－207.(inChinesewithEnglishabstract)0引言厌氧消化是处理畜禽粪便的有效途径。它不仅能提供清洁能源，而且实现了畜禽养殖废弃物无害化处理及多层次资源化利用[1]，现代养殖业通常在饲料中添加一些微量元素（含有重金属Cu、Zn、As等）[2]，而畜禽对这些重金属元素的吸收率很低，95%以上重金属随粪便排出[3-4]，导致粪便中含有较高浓度的Cu、Zn和As等重金属[5]。对厌氧消化器性能的研究表明，重金属的毒性是导致消化器不稳定和失败的主要原因之一，重金属的毒性归因于重金属对酶的结构和功能的破坏，重金属通过与蛋白分子硫醇基或其他基团的结合，或者取代酶辅基中本身的金属从而对酶的结构造成破坏[6]。厌氧发酵是一个体系复杂的微生物化学代谢过程，由3个连续的阶段组成，第一阶段为水解阶段、第二阶段为产氢产乙酸阶段、第三阶段为产甲烷阶段[7]，秸秆中纤维素类物质的含量较高，不易被微生物降解，成为整个沼气发酵过程中的限收稿日期：2011-07-29修订日期：2012-04-13基金项目：国家自然科学基金（40771109，40871119）；农业部“948”项目（2010-Z20）作者简介：陈琳（1985－），女，河北邢台人，主要从事农业废弃物资源化利用研究。杨凌西北农林科技大学理学院，712100。Email：[e-mail]※通信作者：谷洁（1963－），男，陕西周至人，教授，博士，主要从事农业废弃物的资源化利用研究。杨凌西北农林科技大学资源环境学院，712100。Email：[e-mail]速因素，前人已对外源添加纤维素酶提高沼气产气率进行了研究[8]，而关于沼气发酵过程中内源纤维素酶活性动态变化的报道却很少。蔗糖酶是一种重要的水解酶，可以把蔗糖水解为葡萄糖和果糖，以满足微生物生长发育对碳源和能源的需求[9]。有研究表明，可溶性糖含量升高，能有效促进微生物的活性，从而提高产气量[8]。另外蔗糖酶活性与纤维素酶有密切的相关性[9]。脲酶是将尿素转化为氨的水解酶[10]，NH4+-N在厌氧反应器中可能起多重作用，一方面产甲烷菌主要利用NH4+-N作为氮源[11]，NH4+-N提供了厌氧体系的部分碱度；另一方面提高NH4+-N浓度会对体系产生较强的抑制作用[12]。本文从纤维素酶作用底物及蔗糖酶和脲酶作用产物在厌氧体系中的重要性方面考虑，研究重金属Cu对发酵过程中这3种水解酶活性及厌氧消化产气进程的影响，为提高厌氧发酵产气效率，实现畜禽粪便资源高效利用提供参考。1材料与方法1.1试验材料小麦秸秆，取自陕西省杨凌沼气示范村—崔西沟村；猪粪，取自崔西沟村农户家，农民以饲草和麦麸养猪，不含饲料添加剂；小麦秸秆及猪粪主要成分及含量见表1。接种物，取自常温厌氧发酵沼气池中的沼液，总固体质量分数为8%。每个消化瓶内加入反应料液2000g，其中预处理后小麦秸秆284g、猪粪128g、接种物400g、自来水1188g。试验材料本身共含铜49.70mg/kg，其中猪粪含Cu34.60mg/kg、小麦秸秆含Cu15.10mg/kg。第9期陈琳等：Cu对厌氧发酵中水解酶活性及沼气产量的影响203表1试验材料基本性质Table1Basicparametersofexperimentmaterials试验材料总有机质/(g·kg-1)全氮/(g·kg-1)全磷/(g·kg-1)全钾/(g·kg-1)含水率/%全铜/(mg·kg-1)碳氮比猪粪409.7034.509.7010.5836.5734.6011.88小麦秸秆396.106.301.8612.4028.5015.1062.871.1.1试验材料预处理小麦秸秆预处理：将小麦秸秆去根及穗，自然风干，粗粉碎后，过筛（粒径大小2mm），置于12L塑料桶内，加入占沼液和秸秆总质量（湿重）为70%的沼液[13]和0.8%的微生物腐解菌剂（该菌剂由西北农林科技大学资环学院提供，由本课题组筛选并通过鉴定[14]），该菌剂主要由枯草芽孢杆菌、小孢链霉菌、康宁木霉、球毛壳4种微生物菌株组成。塑料桶置于37℃水浴锅内进行恒温好氧生物预处理，3d后充分搅拌一次，预处理7d至秸秆局部发黑并有白色菌丝产生，预处理完成后作为发酵原料装罐发酵。1.2试验装置试验装置主要由2500mL细口消化瓶、2000mL的集气瓶和2000mL排水瓶三部分组成。排水瓶用于收集从集气瓶中被排出的水，以计算产气量。消化瓶置于37℃恒温水浴锅内，消化瓶与集气瓶瓶口用胶塞塞紧，各部分用乳胶管连接，所有接口处均用石蜡和凡士林密封。1.3试验设计取预处理后的麦秆和鲜猪粪，根据2种原料含水率及C/N加水调至总固体质量分数（totalsolid，TS）为8%，C/N=25∶1，接种沼液量为20%（按湿重计）。根据畜禽粪便中Cu含量状况[15]本试验共设4个处理（如表2）：不添加外源Cu（简称CK处理）；添加外源Cu为干猪粪的300mg/kg（简称L处理）；添加外源Cu为干猪粪的600mg/kg（简称M处理）；添加外源Cu为干猪粪的900mg/kg（简称H处理）以模拟Cu污染猪粪，将CuSO4溶液与原料搅拌均匀装入消化瓶内，密封发酵，每个处理2个重复，每天上午9:00记录产气量，定期从消化瓶内取样进行各指标的测定。表2试验设计Table2Experimentaldesign代码处理添加Cu质量分数/(mg·kg-1)实际Cu质量分数/(mg·kg-1)CK不添加外源Cu049.70L添加低浓度外源Cu300349.70M添加中等浓度外源Cu600649.70H添加高浓度外源Cu900949.701.4试验方法试验材料全Cu含量测定方法为HF-HCl-HNO3微波消解一原子吸收分光光度法；总有机质含量采用重铬酸钾法；全氮含量采用凯氏定氮法；全磷含量采用钼锑抗比色法；全钾含量采用火焰光度法测定。1.4.1发酵过程水解酶活性测定水解酶活性测定方法参照关松荫的方法[16]。其中纤维素酶和蔗糖酶活性以24h后1g样品中生成葡萄糖的毫克数表示，mg/(g·d)；脲酶活性以24h后1g样品中生成NH3—N的毫克数表示，mg/(g·d)。1.4.2数据处理数据采用Excel（V2003）、SAS（V8.1）和SPSS（V17.0）软件进行统计分析。用Excel（V2003）软件包进行绘图。2结果与分析2.1厌氧发酵过程中纤维素酶活性的变化农作物秸秆由纤维素、半纤维素、木质素等组成，纤维素在纤维素酶的作用下水解为纤维二糖，进而水解为葡萄糖[10]，由图1可知，纤维素酶活性先升高后降低，CK、L处理在发酵的第20天酶活性达到最高值，分别为4.648和4.268mg/(g·d)，而M、H处理酶活性的分别于第7天和第11天达到最高值，分别为4.249和4.242mg/(g·d)。在整个发酵过程中CK、L、M、H处理纤维素酶活性的平均值分别为：（3.909±0.104）、（3.787±0.161）、（3.677±0.186）、（3.712±0.097）mg/(g·d)，方差分析结果表明，CK处理的纤维素酶活性显著高于M、H处理(p0.05)，表明添加外源Cu会对沼气发酵料液中纤维素酶活性产生明显的抑制作用。整个发酵过程中，CK、L、M、H4个处理纤维素酶活性变化曲线拟合方程分别为：y1CK=-0.0016x2+0.0751x+3.4642，R12CK=0.7177；y1L=-0.0012x2+0.0588x+3.4352，R12L=0.6568；y1M=-0.0013x2+0.0624x+3.2996，R12M=0.4642；y1H=-0.0016x2+0.0819x+3.0512，R12H=0.6337（式中，x表示发酵天数，d；y1表示纤维素酶活性，mg/(g·d)；R12表示纤维素酶活性方程拟合系数）。M、H处理变异系数较大，分别为10.40%、11.13%，而CK、L处理分别为9.30%、7.85%，由以上分析可知，添加外源Cu使发酵料液中纤维素酶活性变化趋势发生很大变异，可能是添加Cu后使得料液中微生物数量和群落结构发生变化，料液中水解纤维素相关类群微生物的生长受到影响。图1厌氧发酵过程中纤维素酶活性的变化Fig.1Variationsofcellulaseactivitiesduringanaerobicfermentationprocess2.2厌氧发酵过程中蔗糖酶活性的变化蔗糖酶是一种重要的水解酶，可以把蔗糖水解为葡萄糖和果糖，以满足微生物生长发育中对碳源和能源的需求。由图2可以看出，发酵料液中蔗糖酶活性在发酵农业工程学报2012年204初期先降低后升高，原因可能是由于发酵初期，分泌蔗糖酶的微生物不能适应厌氧环境，分泌的蔗糖酶数量减少而造成蔗糖酶活性急剧下降，微生物经过驯化后，蔗糖酶活性逐渐回升，在发酵的第11天4个处理（CK处理、L处理、M处理、H处理）蔗糖酶活性达到峰值，分别为：55.808、62.968、55.606、50.843mg/(g·d)，L处理蔗糖酶活性最高，其次为CK、M、H处理。可以看出，低浓度的Cu对蔗糖酶活性有促进作用，而高浓度的Cu对蔗糖酶活性有抑制作用，CK、L、M处理蔗糖酶活性在发酵中后期持续下降，而H处理在发酵的第31～43天蔗糖酶活性高于其他3个处理，原因可能是发酵后期原料通过厌氧消化形成的中间产物与Cu螯合，使Cu浓度正好处于激活效应的范围[17]。4个处理蔗糖酶活性的平均值分别为：（42.85