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第六节高效液相色谱仪图21－10高效液相色谱仪方块图虚线表示不是所有仪器都有的装置一、输液泵目前多用柱塞往复泵。图21－11柱塞往复泵示意图1.柱塞往复泵(图21－11)分析型的柱塞往复泵的容积一般只有0.1～lml，容易清洗和更换流动相。柱塞往复泵属于恒流泵，流量不受柱阻影响。泵压一般最高为40Mpa(400kg/cm2)。这类泵的优点很多，但输液的脉动性较大是其缺点。目前多采用双泵补偿法克服脉动性。按泵联接方式分为并联式与串联式，后者较多，因为它(图21－12右)可节约一对单向阀。将两个柱塞往复泵串联，泵1的缸体容量比泵2大一倍，两者的柱塞运动方向相反。当泵1吸液时，泵2排液；当泵1排液时，泵2吸取泵1输液的1／2量，另1／2量输出。如此，泵1弥补了在泵2吸液时的压力下降，减小了输液脉冲。Waters公司等的串联输液泵，两个泵头分别用两个由微机控制的马达驱动活塞运动，可达到无脉动溶剂输出。图21－12柱塞往复泵的二种连接方式(串联式中的泵2无单向阀)对输液泵的要求是：无脉动、流量恒定、并可自由调节。一般流量变化要求在2％～3％以内(高级输液泵的精密度RSD可达±0.075％)。还要求耐高压、耐腐蚀、适于进行梯度洗脱等。两个并联式往复泵的输出流量/压力曲线泵1泵2合成输出曲线两个串联式往复泵的输出流量曲线2.梯度洗脱装置按多元流动相的加压与混合顺序，可分为高压与低压梯度两种洗脱装置。高压二元梯度洗脱是由两个输液泵分别各吸一种溶剂，加压后再混合，混合比由二个泵的速度决定。低压梯度洗脱是用比例阀将多种溶剂按比例混合后，再加压输至色谱柱。低压梯度便宜，且易实施多元梯度洗脱，但重复性不如高压梯度洗脱装置。现代高效液相色谱仪，都由微机控制，洗脱曲线可以指定任意形状(阶梯形、直线、曲线)。梯度洗脱的缺点是重复性不如恒组成洗脱。去泵二、色谱柱与进样器色谱柱是色谱仪最重要的部件。完整的色谱柱系统包括进样器、色谱柱、柱的进出口接头及至检测器的导管等。现选主要部分叙述如下:1.进样器进样器装在色谱柱的进口处，目前产品都配置六通进样阀（下图）。贮样管的体积固定，可按需更换。41图21－13六通阀示意图1.贮样管2.样品入口3.流动相进口4.色谱柱优点：进样量准确、重复性好、可带压进样等。2.色谱柱柱管多用不锈钢制成，管内壁要求具有很高的光洁度。固定相采用匀浆法高压(50～100MPa)装柱。•分析型常量柱:内径(I.D.)2～4.6mm，柱长10～25cm•半微量柱:内径1～1.5mm，柱长10～20cm•实验室制备型柱内径20～40mm，柱长10～30cm。3.色谱柱柱效的评价柱效评价可以了解所用色谱柱是否合乎要求。《中国药典》1995版附录中规定，用高效液相色谱法或气相色谱法建立分析方法时，需进行“色谱条件与系统适用性试验”，给出分析状态下色谱柱(应达到的)最小理论塔板数、分离度和拖尾因子。分析样品时，需检验柱性能是否合乎要求。可见柱效评价的重要意义。常用色谱柱柱效评价条件见教科书。434.色谱柱的再生色谱柱的价格较贵，再生可以延长使用柱寿命。反相色谱柱以甲醇水(95:5，V/V)、纯甲醇及二氯甲烷等为流动相，依次冲洗，顺序不得颠倒。每种流动相的冲洗体积应20倍于柱体积。然后，再以相反顺序依次冲洗。正相色谱柱(含硅胶柱)以严格脱水的正己烷、异丙醇、二氯甲烷及甲醇为流动相，依次冲洗，顺序不得颠倒。其它步骤同上。三、检测器对检测器的要求：•灵敏度高•噪声低•线性范围宽•重复性好•适用化合物的种类广等目前应用最多的检测器•紫外检测器(UVD)•荧光检测器(FD)•电化学检测器(ECD)•示差折光检测器(RID)通用型，灵敏度不够高•蒸发光散射检测器及发光检测器有发展前途(一)紫外检测器紫外检测器(ultravioletdetector；UVD或UV)检测原理测定样品组分通过流通池时对特定波长紫外线的吸收，获得浓度时间曲线。浓度与吸光度的关系服从LambertBeer定律。检测系统由光源、流通池(池体积一般为8mL)、检测元件、微机(工作站)及记录器等组成。特点①灵敏度高。最高可达0.00lAUFS—满度吸光度单位)；噪音低，最小检出量可达107～1012g。②非破坏性，能与其它检测器串联，可用于制备。③对温度及流动相流速波动不敏感，可用于梯度淋洗。④属浓度型检测器46弱点：①只能检测有紫外吸收的样品②流动相的选择有一定限制，检测波长必须大于流动相的截止波长。截止波长用1cm光径的吸收池装溶剂，用空气为参比，改变照射波长，当吸光度A=1时，此时的波长称为该溶剂的截止波长。例常用纯溶剂的截止波长:水190、乙腈190、甲醇205、正己烷210、乙醚220、四氢呋喃225、二氯甲烷245及氯仿245nm。紫外吸收检测器的类型光源波长固定(一般为254nm)的检测器已基本淘汰。1.可变波长型检测器波长可按需要选择。可选择被测组分的最大吸收波长为检测波长，以增加检测灵敏度。但由于光源是通过单色器分光后再照射到样品上，照射光强度相应减弱。因此，这类检测器对检测元件(光电转换元件)及放大器都有较高的要求。UVD是当前高效液相色谱仪配置最多的检测器。其光学结构与一般的紫外分光光度计一致，主要区别是用流通池替代了比色池。482.光电二极管阵列检测器(photodiodearraydetector，DAD)由于有些色谱组分在流通池中停留时间很短(l秒)，普通紫外分光光度计的扫描速度跟不上，若停留扫描则破坏了分离状态。因而，50年代出现了DAD。其中一般是一个光电二极管对应接受光谱上大约一个纳米(nm)谱带宽度的单色光。工作原理当复合光透过流通池后，被组分选择性吸收，透过光具有了组分的光谱特征。此透过光(复合光)被光栅分光后，形成组分的吸收光谱，照射到光电二极管阵列装置上，使每个纳米光波的光强变成相应的电信号强度，因信号弱需经多次累加，而后给出组分的吸收光谱。这种记录方式不需扫描，因此最短能在几个毫秒的瞬间内获得流通池中色谱组分的吸收光谱。49图21－14光电二极管阵列检测器示意图190nm800nm190nm512个光电二极管用二极管阵列装置可以同时获得样品的色谱图(Ct曲线)及每个色谱组分的吸收光谱(Al曲线)。前者用于定量，后者用于定性。将这两种图谱绘在一张三维坐标图上(Xt、YA、Zl)，而获得三维光谱色谱图(3Dspectro-chromatogram)(见下图)，同时得到定性、定量信息。紫外检测器的检测灵敏度高，但主要用于检测具有pp或p-p共轭结构的化合物。如芳烃与稠环芳烃、芳香基取代物、芳香氨基酸、核酸、甾体激素、羧基与羰基化合物等。检测只含有p-p共轭结构的化合物(脂肪羧酸、酮及醛等)时，需用末端吸收。一般来说，末端吸收的吸收系数不大，因此这时测定的灵敏度较低，并且因在末端有吸收的物质很多，因此干扰较大。图21－153D光谱色谱图(二)荧光检测器(fluorophotometricdetector；FD)具有流通池的荧光分光光度计(光路图见第13章)。荧光检测器的检测限可达11010g/ml，比紫外检测器灵敏，但只适用于能产生荧光或其衍生物能发荧光的物质。主要用于氨基酸、多环芳烃、维生素、甾体化合物及酶类等的检测。由于荧光检测器的灵敏度高，是体内药物分析常用的检测器之一。在用于氨基酸检测时，由于多数氨基酸无荧光，需用柱衍生法制备衍生物。衍生法分为柱前与柱后衍生二种方法。常用邻苯二甲醛(OPA)或异氰硫基苯(PICO－TAG法)为衍生化试剂，是分析氨基酸应用最广的方法之一，分析实例见第七节。53(三)蒸发光散射、化学发光及安培检测器l.蒸发光散射检测器(evaporativelightscatteringdetector，ELSD)90年代出现的最新型的泛用检测器。理论上这种检测器可用于挥发性低于流动相的任何样品组分的检测，但对于有紫外吸收的组分的检测灵敏度较低，因而主要用于糖类、高分子化合物、高级脂肪酸及甾体类等几十类化合物。该检测器用于检测糖类时，最小检测量为5ng葡萄糖。ELSD还可用于凝胶色谱及超临界流体色谱的检测。54检测原理将流出色谱柱的流动相及组分先引入通载气(常用高纯氮)的蒸发室，加热，使流动相蒸发而除去。样品组分在蒸发室内形成气溶胶，被载气带入检测室，用激光或强光照射气溶胶而产生散射光(丁铎尔光效应)，测定散射光强而获得组分的浓度信号。散射光强I与进入检测器的气溶胶中组分的质点的“质量和”m的关系为:I=kmbk、b是两个与实验条件有关的常数(是取对数后的截距与斜率)。552.化学发光检测器(chemolunimescencedetector,CL)化学发光检测器是近年来发展起来的高选择性及高灵敏度的新型检测器。该检测器设备简单，自身发光不需光源，价格便宜，而且可以自制，是一种有发展前途的检测器。化学发光反应常用酶为催化剂，将酶标记在待测物、抗原或抗体上，可进行药物代谢分析及免疫发光分析。该检测器在药物分析与药理研究上，刚开始应用，应给予高度重视。检测原理某些物质在常温下与发光试剂反应，生成处于激发态的产物，当它们由激发态返回基态时发射光子。由于物质激发态的能量来源于化学反应，因此称为化学发光。当被分离组分由色谱柱流出后，与发光试剂反应，而产生光辐射，其光强与该组分的浓度成正比。这种检测器的最小检测量可达pg级(1012g)。563.安培检测器(Amperedetector，AD)电化学检测器包括电导检测器、安培检测器及极谱检测器等。电导检测器主要用于离子色谱；安培检测器与极谱检测器可用于可氧化、还原的物质的检测。安培检测器应用较广，对有机还原性物质的检测限可达11012g／ml，灵敏度很高，但不能检测不参加氧化、还原反应的物质。检测原理利用组分的氧化还原反应产生电流的变化，而进行检测。检测器相当于一个微型电解池。当被分析组分通过电极表面，在两电极间施加超过该组分氧化(或还原)电位的恒定电压时，组分将被电解，而产生电流，服从法拉第定律。受环境温度影响较大是其缺点。其它尚有红外检测器、介电常数检测器及放射性检测器等。第七节定性、定量分析方法及应用与示例一、定性分析方法HPLC的定性方法可为色谱及非色谱鉴定法两类。1.色谱鉴定法利用纯物质和样品的保留时间或相对保留时间相互对照，进行定性分析，2.化学鉴定法利用专属性化学反应对分离后收集的组分定性。由于用HPLC收集组分比GC容易，因此该法是较实用的方法之一。3.结合色谱分离与质谱或光谱的鉴定法(1)离线色谱分离质谱或光谱鉴定方法：把HPLC作为分离手段，制备纯组分，而后用光谱仪器鉴定。要求分离度足够大。IR与MS需样量约1mg，NMR需样量较大，一般需3mg以上，太少需增加累加次数。(2)联用仪（在线分析）将高效液相色谱仪与光谱仪(或质谱仪)用界面联接成一个完整仪器，实现在线检测，称为联用仪。两谱联用仪能给出样品的色谱图，并能快速给出每个色谱组分的光谱(或质谱)图，能同时获得定性、定量信息。是当今成分复杂样品分析、鉴定的最重要手段。最常见的是HPLCUV联用仪，它能给出HPLCDADUV三维谱，但定性效果一般。HPLCMS联用仪是当前天然药物成分、药理与临床研究的最重要的联用仪器，但接口技术是关键，电喷雾离子源是当前较理想的接口。大气压化学电离离子源，也是HPLCMS联用仪常用的离子源。二、定量分析方法液相色谱法的定量方法与气相色谱法相同。在液相色谱分析中，较少使用校正归一化法。常用外标法及内标对比法等进行定量分析。1.外标法以待测组分的纯品作对照物质，对比求算试样含量的方法。外标法可分为•外标工作曲线法•外标一点法•外标二点法等。优点：不需要知道校正因子，只要被测组分出峰、无干扰、保留时间适宜，就可进行定量分析。缺点：进样量必须准确，否则定量误差大。外标工作曲线法外标一点法外标两点法在HPLC中，因进样量较大(l0ml或以上)，而且用六通阀定量进样，进样量误差相对较小，因此外标法是HPLC常用定量方法之一。外标工作曲线法