HPLC荧光法研究二巯基丁二酸在小鼠体内的组织分布特性刘世军

中国药房2011年第22卷第5期ChinaPharmacy2011Vol.22No.5＊主任药师。研究方向：医院药学。电话：[phone]。E-mail：[e-mail]#通讯作者：教授，博士研究生导师。研究方向：药物代谢。电话：[phone]。E-mail：[e-mail]二巯基丁二酸（meso-2，3-dimercaptosuccinicacid，DM-SA）是一种含有2个活性巯基的金属螯合剂，已被美国食品与药物管理局（FDA）批准为口服驱铅治疗药物并应用于儿童铅中毒[1～3]。与传统的解毒药物依地酸钙钠（EDTACa-Na2）和二巯基丙醇（BAL）相比较，DMSA给药方便，无需静脉或肌肉注射，易为患儿接受，治疗过程中无需住院治疗，有利于降低医疗费用；与口服驱铅制剂青霉胺相比，DMSA的优点是可选择性排铅，不会同时排出人体必需的锌、铁和铜等[3，4]，因此DMSA作为口服治疗重金属中毒的药物在临床上应用日益普遍，故有必要充分了解其在机体内的吸收、分布、代谢等过程，然而该方面的研究国内少有文献报道。同时，高效液相色谱（HPLC）-荧光法因具有灵敏度高、重复性好、衍生化产物相对稳定等优点，常用于生物样品中巯基化合物的分析[1]。为此，笔者以小鼠为研究对象，采用HPLC-荧光法研究DMSA胶囊在小鼠体内的组织分布特性。1仪器与材料HPLC-荧光法研究二巯基丁二酸在小鼠体内的组织分布特性刘世军1＊，崔晞2#，孙克明1，刘宪勇1，张敏1，王岩1（1.武警山东总队医院药剂科，济南市250014；2.山东大学公共卫生学院卫生检验研究所，济南市250012）中图分类号R979.3；R969文献标识码A文章编号1001-0408（2011）05-0413-04摘要目的：研究二巯基丁二酸（DMSA）在小鼠体内的组织分布特性。方法：采用高效液相色谱（HPLC）-荧光法。生物样品在加入巯基衍生化试剂mBBr后进行检测。色谱柱为AichromBond-AQC18，流动相为甲醇-水（40∶60，V/V，含四丁基溴化铵和乙酸钠），流速为1.0mL·min－1，柱温为30℃；荧光检测器Ex＝356nm、Em＝450nm。取健康昆明小鼠36只，随机分为6组，1组为空白组，其余5组为给药组。给药组一次性灌胃给予0.5mL的2.6mg·mL－1DMSA后0.5、2、4、6、12h摘眼球取血及脑、心脏、肺脏、肠、肝脏、脾脏和肾脏，测定DMSA含量。结果：DMSA在各种生物样品中检测浓度线性关系良好，r均大于0.996，在脑和其他样本中定量下限分别为0.025、0.1µg·mL－1，萃取回收率均大于75％，日内、日间RSD均小于15％。小鼠给药后0.5h即在肠、肝脏、心脏及血液中达药物浓度峰值，2h后在其他脏器中达峰值；分布浓度由高到低排序为肾脏＞血液＞肠＞肺脏＞肝脏＞脾脏＞心脏＞脑。结论：所建立的分析方法准确性好，专属性强，内源性物质干扰小，可以满足对DMSA在小鼠体内过程的研究。小鼠口服DMSA后迅速吸收、分布及消除，并主要经肾脏、肝脏代谢、排泄。关键词二巯基丁二酸；小鼠；组织分布；高效液相色谱-荧光法；衍生化TissueDistributionStudyofDimercaptosuccinicAcidinMicebyHPLC-FluorescenceMethodLIUShi-jun，SUNKe-ming，LIUXian-yong，ZHANGMin，WANGYan（Dept.ofPharmacy，ShandongGener-alTroopsHospitalofChinesePeople’sArmedPoliceForces，Ji’nan250014，China）CUIXi（InstituteofChemistryandBacterialDetection，CollegeofPublicHealth，ShandongUniversity，Ji’nan250012，China）ABSTRACTOBJECTIVE：Tostudythetissuedistributionofdimercaptosuccinicacid（DMSA）inmice.METHODS：HPLCwithfluorescencemethodwasadopted.Thebiologicalsamplesweretreatedwithsulfhedrylderivatizationreagent.Thedetermina-tionwasperformedonAichromBond-AQC18columnwithmobilephaseconsistedofmethanol-water（40∶60，V/V，containingtetra-butylammoniumbromideandsodiumacetate）andflowrateof1.0mL·min－1.Thecolumntemperaturewas30℃.Thefluores-cencedetectorequippedwith356nmexcitationand450nmemissionfilterswasusedformeasurementofpeaks.36healthyKun-mingmicewererandomlydividedinto6groups.Onegroupwascontrolgroup，theother5groupsforthedruggroup.Druggroupwasgiven2.6mg·mL－1DMSA0.5mLviai.g.gtt.Thesamplesofblood，brain，heart，lungs，intestines，liver，spleenandkidneywerecollectedandtheDMSAwasdetermined0.5，2，4，6，12hafteradministration.RESULTS：ThegoodlinearrangeofDMSAhadbeenobtained（r＞0.996）.Thelowestdetectionlimitofbrainandothersampleswere0.025µg·mL－1and0.1µg·mL－1.Theex-tractionrecoverywasmorethan75％andtheRSDofintra-dayandinter-daywerelessthan15％.Thepeaksofdrugconcentrationwerereachedat0.5hinintestine，liver，heartandblood，andat2hinkidney，lung，spleenandbrainafteranoraladministrationofDMSA.TheconcentrationofDMSAintissueswasfollowedas：kidney＞blood＞intestine＞lung＞liver＞spleen＞heart＞brain.CONCLUSIONS：Themethodisaccurate，specificandreliablewithlessinterferenceofendogenoussubstances，anditcanbeap-pliedtothestudyofDMSAinmicetissue.Afteranoraladministration，theDMSAisrapidlyabsorbed，distributedandeliminated.ThetissuedistributionofDMSAisexcretedviakidneyandliver.KEYWORDSDimercaptosuccinicacid；Mice；Tissuedistribution；HPLC-fluorescencemethod；Derivatization··413ChinaPharmacy2011Vol.22No.5中国药房2011年第22卷第5期1.1试药DMSA胶囊（山东达因海洋生物制药股份有限公司，批号：050901，规格：每粒0.25g）；DMSA对照品（美国Sigma公司，批号：D7881-1G，纯度：98％）；荧光试剂Monobromobimane（mBBr，美国Fluka公司，批号：69898，纯度：≥95％）；二硫苏糖醇（DTT，美国AlfaAesar公司，批号：J6516A，纯度：99.5％）；甲醇、乙腈、二氯甲烷、醋酸均为色谱纯；氢氧化钠、碳酸氢铵、四丁基溴化铵、乙酸钠及盐酸均为分析纯；水为双蒸水。1.2动物清洁级，健康昆明小鼠，体重（18.7±1.3）g，♀♂各半，山东大学实验动物中心提供，合格证号：20050406。1.3仪器HPLC仪，包括SCL-10AVP控制器、LC-10ATVP泵、RF-10AXL、7725I进样阀、LCSolution工作站（日本Shimadzu公司）；HT-230A色谱柱恒温箱（天津市恒奥科技发展有限公司）；AX-205电子天平（梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司）；XW-80A型旋涡混合器（上海精科实业有限公司）；PROINO离心机（美国科峻仪器公司）。2方法与结果2.1药物浓度测定方法2.1.1色谱条件。色谱柱为AichromBond-AQC18（150mm×4.6mm，5μm）；流动相：甲醇（含10mmol·L－1四丁基溴化铵、10mmol·L－1乙酸钠）-水（含10mmol·L－1四丁基溴化铵，10mmol·L－1乙酸钠，乙酸调pH值为4.1）＝40∶60（V/V）；流速：1.0mL·min－1；柱温：30℃；荧光检测器：Ex＝356nm，Em＝450nm；进样量：20μL。2.1.2样品预处理。（1）血液：在避光条件下，血液用双蒸水稀释10倍后取125μL，加入15mg·mL－1DTT溶液（溶于0.1mol·L－1碳酸氢铵溶液）25μL，加入0.1mol·L－1碳酸氢铵溶液350μL，于室温下暗室中孵育30min。加入10mg·mL－1mB-Br（溶于乙腈）100μL，吹N215s，封口，涡旋30s，于室温下暗室中孵育10min。加入乙腈1mL，旋涡混合1min，1.2×104r·min－1离心5min。取上清液，加二氯甲烷2mL，旋涡混合1min，5×103r·min－1离心5min。取上层水相，用3mol·L－1盐酸溶液调节pH至6～7，进样20μL。测定峰面积，外标法计算DMSA在生物样品中的浓度。（2）心脏、肺脏、肠、肝脏、脾脏和肾脏组织：在避光条件下，准确称量组织的重量，加0.1mol·L－1碳酸氢铵溶液制备成20％（肾脏10％）组织匀浆，取组织匀浆125μL，按“血液”项下“加入15mg·mL－1DTT溶液”起操作。（3）脑组织：在避光条件下，准确称量脑组织的重量，加0.1mol·L－1碳酸氢铵溶液制备成20％组织匀浆，取组织匀浆500μL，按“血液”项下“加入15mg·mL－1DTT溶液”起操作。2.1.3标准溶液的制备。准确称取DMSA对照品10mg，置于10mL容量瓶中，加0.2mol·L－1氢氧化钠溶液溶解，定容至10mL，得浓度为1.0mg·mL－1的标准贮备液，－20℃避光保存，备用。2.2方法学考察2.2.1方法专属性。取空白血液、空白血液+DMSA（5.6µg·mL－1）、灌胃给药后2h小鼠血液样品、肺脏样品进样分析，通过比较空白生物样品、对照品、添加对照品的空白生物样品与生物样品色谱图，评价方法的专属性，结果见图1。由图1可见，将空白生物样品与生物样品色谱图进行比较，结果表明生物样品经处理后，其中内源性物质衍生化产物和mBBr水解产物主要分布于色谱图的0～10min范围内，DTT反应产物介于10～15min之间[1]，均不干扰DMSA衍生化产物（DMSA-mBBr）的测定。2.2.2标准曲线和线性范围。取空白血液及各脏器匀浆各8份，分别精确加入DMSA标准溶液适量，混匀，使浓度分别为0.1、0.2、0.