MBR活性污泥培养驯化过程中生物多样性研究

第32卷第9期2012年9月环　境　科　学　学　报　ActaScientiaeCircumstantiaeVol.32,No.9Sep.,2012基金项目:天津市自然科学基金重点项目(No.07JCZDJC02100)SupportedbytheNaturalScienceFoundationofTianjin(No.07JCZDJC02100)作者简介:于凤庆(1984—),男,E-mail:[e-mail];∗通讯作者(责任作者),E-mail:[e-mail]:YUFengqing(1984—),male,E-mail:[e-mail];∗Correspondingauthor,E-mail:[e-mail]于凤庆,孙宝盛,陈谊,等.2012.MBR活性污泥培养驯化过程中生物多样性研究[J].环境科学学报,32(9):2084-2090YuFQ,SunBS,ChenY,etal.2012.StudyonbiologicaldiversityoftheMBRactivesludgecultivationprocess[J].ActaScientiaeCircumstantiae,32(9):2084-2090MBR活性污泥培养驯化过程中生物多样性研究于凤庆1,孙宝盛1,∗,陈谊1,2,杜江1,周强健11.天津大学环境科学与工程学院,天津3000722.中国石化集团宁波工程有限公司,宁波315103收稿日期:2011-11-17　　　修回日期:2011-12-14　　　录用日期:2011-12-19摘要:以MBR反应器启动调试阶段的活性污泥为主要研究对象,系统考察了传统活性污泥法(Conventionalactivatedsludge,CAS)污泥接种至MBR反应器内污泥培养驯化过程中生物多样性情况及微生物群落结构的演变规律.同时,在传统污水污泥检测指标的基础上,对各阶段污泥中总细菌基因组DNA进行提取,应用PCR-DGGE分子生物学技术获得了相应的凝胶电泳图谱并进一步分析了菌群间的相似性.结果表明,以CAS污泥为接种污泥在MBR反应器内培养驯化过程中微生物的多样性变化突出,细菌群落结构演替明显,不同阶段菌群间的相似性说明了各阶段菌群的演变关系:污泥培养驯化是一个逐步有序的过程,微生物随反应器内不同时期及环境的变化而调整,逐渐演变成适应MBR工艺的群落结构.关键词:MBR;污泥驯化;PCR-DGGE;生物多样性文章编号:0253-2468(2012)09-2084-07　　　中图分类号:X703　　　文献标识码:AStudyonbiologicaldiversityoftheMBRactivesludgecultivationprocessYUFengqing1,SUNBaosheng1,∗,CHENYi1,2,DUJiang1,ZHOUQiangjian11.SchoolofEnvironmentScienceandTechnology,TianjinUniversity,Tianjin3000722.SinopecNingboEngineeringCompanyLimited,Ningbo315103Received17November2011;　　　receivedinrevisedform14December2011;　　　accepted19December2011Abstract:ToinvestigatethesuccessionofthestructureofmicrobialcommunityandthemicrobialdiversityofMBRintheentirecultivationprocess,thesludgeinthetrainingdomesticatedstageofanMBRreactorwasstudiedbyusingtheconventionalactivatesludgemethod.Basedontheconventionalwastewatersludgeindexes,totalbacterialgenomicDNAindifferentstageswasextractedfromtheMBRsludge,andthePCR-DGGEandsimilarityanalysiswereapplied.ItwasshownthatintheprocessofcultivationofCASintheMBRreactor,thechangeofdiversityandsuccessionprocedureofbacteriawereobvious,andthesimilarityindexofbacteriaineachstageshowedthesuccession.Thecultivationofsludgewasasequencingprocess,whichwasduetotheself-modulationofthemicroorgannismstotheenvironmentchangesindifferentperiodoftime,formingthecommunitystructurethatwasbestfortheMBRprocess.Keywords:MBR;sludgedomesticated;PCR-DGGE;biodiversity1　引言(Introduction)活性污泥是一种复杂的、具有生物多样性的微生态系统.研究发现,生物多样性是活性污泥驯化的基础,驯化条件对微生物进行选择———适者生存增长,不适者被淘汰或抑制(朱铁群等,2008).虽然活性污泥驯化已经应用了近百年,但人们并不是十分了解活性污泥的驯化机理,只是推测可能涉及到微生物细胞启动诱导酶的合成和微生物群落正向自发突变的积累.近十几年,包括PCR-DGGE等在内的分子生物学技术被广泛应用于活性污泥研究(Wagneretal.,2002),使活性污泥的微生物群落结构及驯化期间的变化被逐渐揭示出来.MBR反应器具有污泥龄长、水力剪切力大和F/M值(供给污泥的食料与污泥质量比)较小等特点,它的微生物群落结构应该与相同状况下的CAS9期于凤庆等:MBR活性污泥培养驯化过程中生物多样性研究污泥有很大的不同(Yukietal.,2007),因此,对于CAS污泥接种至MBR反应器内污泥培养驯化过程中生物多样性情况及微生物群落结构的演变规律有必要开展深入的研究.虽然目前有一些关于MBR反应器中细菌群落结构的调查研究成果(Witzigetal.,2002,张斌等,2008a,孙宝盛等,2008),但这些研究大部分以人工合成废水的小试和中试为主.因此,研究MBR在实际工程运行时活性污泥生物多样性和群落结构特征,对于其推广应用和工艺优化具有十分重要的意义.基于此,本研究对CAS污泥接种至MBR反应器培养驯化过程中生物多样性及微生物群落结构演替情况进行考察,以期找出正常运行时的优势菌种,为MBR的菌种培养及前期调试运行提供理论依据.2　材料和方法(Materialsandmethods)2.1　工艺概述天津某加工区再生水处理厂MBR反应器处理规模为1.5万m3·d-1,原水主要为工业污水和市政污水,建成后进行污泥接种培养驯化.整个MBR池分为缺氧段和好氧段,设计水力停留时间分别为5h和7h,通过污泥回流泵把好氧段的污泥混合液回流至缺氧段,达到硝化-反硝化的目的,膜组件置于好氧段.采用中空纤维膜,每格MBR池有膜组件36套,膜孔径为0.2μm,膜通量为15L·m-2·h-1,气水比为20∶1.2.2　MBR污泥接种及培养驯化接种污泥取自天津某污水处理厂好氧池回流污泥,该污水厂采用A2/O脱氮除磷工艺,主要用于去除有机物并能脱氮除磷,提高出水水质.接种污泥MLSS为5798mg·L-1,污泥沉降比(SV)为23%.接种污泥投加至MBR反应器后MLSS为650mg·L-1.　污泥培养驯化原水为自来水混有部分污水,在培养驯化初期通过投加营养盐来满足微生物生长所需的营养,每天投加一定量的葡萄糖、NH4Cl、KH2PO4及其它一些微量元素,并且使MBR反应器中的C∶N∶P=100∶5∶1,每天投加大约250mg·L-1当量的COD和相应比例的其它营养物质.第20d左右开始进污水,每格池每天进污水400m3,通过静沉排上清液,再进污水,在进污水的同时投加营养盐,然后逐渐增加污水投加量.第40d左右,MBR反应器内污泥浓度达到3000mg·L-1以上后,开始用膜组件进行出水,每格池每天出水量从开始的600m3逐渐上升到第60d时的2000m3左右.再生水厂MBR反应器的进水水质如表1所示.表1　再生水厂MBR反应器进水水质Table1　ThefeedingwaterqualityoftheMBRofareclaimedwastewatertreatmentplantmg·L-1CODCrNH+4-NTNTPSS260~40020~3520~403~5160~2202.3　运行和取样条件从MBR反应器开始驯化到基本进入正常运行,进行了将近2个月的跟踪取样,从接种第3d开始取样,取样频率基本上为每6d取1次,共取样10次.具体取样时间、样品编号、MBR运行工况及去除效果如表2所示.CODCr、NH+4-N、SS、MLSS等常规指标采用国家环保局颁布的标准方法(GB11914—89,HJ535—2009,GB11901—89)进行测定.表2　MBR反应器培养驯化各阶段的运行情况及处理效果Table2　Operationconditionsandtreatmenteffectforvariousstagesofthecultivationanddomesticationprocesses取样阶段样品编号取样时间DO/(mg·L-1)气水比去除率CODCr氨氮SS污泥培养初期C1C2C3第3d第9d第15d4.54.74.520∶1~22∶145%~70%污水驯化阶段C4C5第21d第27d3.93.819∶1~21∶160%~80%低负荷膨胀期C6C7第33d第39d3.23.120∶1~21∶170%~85%恢复正常阶段C8C9C10第51d第57d第63d3.02.92.820∶1~23∶189%93%95%90%92%91%93%94%93%5802环　　境　　科　　学　　学　　报32卷2.4　污泥样品预处理和DNA提取污泥样品预处理:取500mL均匀的污泥混合液,静沉30min后,倒去上清液,取沉淀污泥50mL置于50mL灭菌离心管内,在6~10℃、9165g下离心10min;弃去上清液,再加入30mL灭菌的超纯水并振荡混匀,离心10min;弃上清液后,再加入30mL灭菌的TE缓冲液并混匀,离心10min;倒掉上清液后将所得沉淀污泥重新加入15mL灭菌的超纯水并振荡混匀,取5mL污泥样品用于提取基因组DNA.采用化学裂解-酚\氯仿\异戊醇抽提-试剂盒纯化的方法提取总基因组DNA,具体提取方法参见文献(孙宝盛等,2008).2.5　基因组DNA的PCR扩增将提纯得到的基因组DNA作为模板进行PCR扩增.采用对大多数细菌和古细菌16SrRNA基因V3区具有特异性的引物对F357-GC和R518,扩增产物片段长约240bp(Muyzeretal.,1993).采用50μL反应体系,组成为:10~100ng模板,5μL10×PCRbuffer(含20mmolMgCl2),10mmol·L-1dNTPs1μL,0.5μmol·L-1引物各0.5μL,2.5U·L-1的Taq酶1μL,其余用无菌超纯水补足至50μL.采用降落式PCR反应策略:94℃下预变性5min;前20个循环为94℃变性1min,65~55℃退火1min,72℃延伸1min(其中每个循环后退火温度下降0.5℃);后10个循环为94℃变性1min,55℃