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}交…流}COI,1011皿川CatI00平…台PlanollllMB倪中括貂皿氢自督像厕宜方抉的欢拟周恢,,,,左永生,,赵怀颖,,李明兴`(1.北京科技大学土木与环境学院,北京100083;2.北京科技大学应用学院,北京100083)摘要:以MBR中活性污泥为材料,以硫化钠为还原剂,丙酮为革取剂,对传统丁CT一脱氮酶活性.mJ定法进行了改进,解决了标准曲线制作繁琐和稳定性差的缺点,并时测定中诸多影响因素进行了比较分析,确定了最佳实验条件。关键词:活性污泥;丁下C一脱氮酶活性;革取剂;标准曲线中图分类号:X703文献标志码:B文章编号:1006一5377(2006)12一0031一03ImProvementofDeterminationonSludgeDehydrogenaseActivityinMBRZHOUHui,ZUOOYng一sheng,ZHAOHuai一ying,LlMing一xing与传统活性污泥系统(CAs)相比,膜生物反应器(MBR)中微生物总数多,但污泥停留时间(SRT)较长,生物活性较低。在活性污泥活性的测定中,脱氢酶活性是一个重要参数,它在很大程度上反映了活性微生物量及其对有机物的代谢能力,是一项考察污泥活性的重要指标。测定脱氢酶活性的方法很多,目前国内外大多采用TTC(2,3,5一氯化三苯基四氮哇)一还原法,但该方法存在着标准曲线制作繁琐、萃取剂不理想、测定结果不稳定、重现性较差等问题。本文对还原剂、洗涤剂、基质的添加、培养时间以及萃取剂等诸多影响因素进行了选择比较,为TTC一脱氢酶活性测定方法在膜生物反应器(MBR)中污泥活性测定的进一步推广应用提供完善的依据。材料与方法主要仪器和试剂(l)主要仪器新佳恒温水浴振荡仪、800型离心机、723型分光光度计。(2)主要试剂及配制方法0.4%TTC溶液:取0.2gTTC(2,3,5一氯化只苯基四氮哇,分析纯)溶于少量蒸馏水中,稀释至50mL,贮存于棕色容量瓶中,侮周新配。Tris一HCI缓冲溶液(pH=8.6):称取6.0379Tirs(三轻甲基氨基甲烷,分析纯,北京化学试剂厂),加人20mLI.omol/LHCI,牛I乡定容至llJ。0.36%NaZSO3溶液:取3.6gNaZSO3(分析纯,J匕京化学试剂厂)溶于IL蒸馏水中。TTC标准溶液:称取0.050gTTC,溶f50llllJ蒸馏水中,存于茶色容量瓶中,此溶液即为l,119I/丁TC的标准溶液。0.lmol/L葡萄糖溶液:称取1.98179葡萄糖(分析纯)溶于100mL蒸馏水。1.2样品制备取污泥混合液20mL于锥形瓶中,加玻璃珠振荡将污泥打碎(300Or/min、离心smi:1),弃去_l二清液,CHINAENV旧ONMENTALPROTECT旧NINDUSTRY2006.12交}流{平}合}Comm朋oiCat面onPla叮0犷mO夕i的j用蒸馏水补足,搅拌洗涤三次,再用蒸馏水补足至原体积,用玻璃棒搅匀,备用。1.3试验方法()]标准曲线的绘制在8支25mL具塞比色管中,依次加人ZmLTirs一HCI缓冲液、lmL蒸馏水和lmLTTC系列溶液,对照管不加TTC;再各加人10%的硫化钠溶液1mL,振荡摇匀置于暗处,待溶液充分显色后,各管分别加人smL丙酮,37℃振荡萃取10min,离心smin,取上层有机溶液用723分光光度计在波长492nm处,测定吸光度值,以试剂空白作对照,绘制标准曲线如图l所示。硫酸钠破坏,造成反应溶液中TF量下降。改用硫化钠为还原剂,试验结果发现显色完全,色度稳定,而且吸光度值可保持长时间稳定,因此以硫化钠为还原剂效果较好。2.2样品前处理对脱氮酶活性测定的影响在活性污泥脱氢酶活性测定方面,一般用0.85%的生理盐水洗涤样品。本试验采用蒸馏水和0.85%的生理盐水分别洗涤污泥,进行对比分析,结果如表l所示。表1洗涤方法对脱氮酶活性的影响洗涤剂吸光度蒸馏水0.85%生理盐水0.318TF(ugjmL)图,T(F三茶基甲脂)浓度与其吸光度的关系对该组数据线性回归,得到标准曲线方程为:Y=0.001+0.00846X,相关系数为0.99888。(2)污泥脱氢酶活性的测定取活性污泥制备液ZmL于带塞试管中,依次加人Tris一HCI缓冲溶液1.smL、0.lmol/L葡萄糖溶液、0.4%TTC溶液和0.36%NaZSO3溶液各0.smL,置于37℃生l℃恒温水浴振荡仪中培养Zh后取出,加人0.smL甲醛终止反应,准确加人smL丙酮,37℃士loC振荡萃取10min,在3000r/min的条件下离心smin,492nm处测定吸光度。在上述条件下,lh产生林gTF的量为一个酶活力单位。由表l可见,蒸馏水洗涤的测定效果优于0.85%的生理盐水。用0.85%的生理盐水洗涤污泥,脱氢酶活性低,这可能是由于生理盐水中大量的CI一不利于氯化有机物TTC发生解离。2.3培养时间的确定根据酶活性的测定原则,培养时间应尽量短些,以避免因基质浓度下降、产物的形成以及酶本身的变性所带来的不良影响。但培养时间过短会使得酶促反应可生成的被检测物质的量太少,难以定量检测,因此应选择适宜的培养时间。本试验设置的条件是,每隔30min进行取样测定酶活性,结果如图2所示。2结果与讨论2.1标准曲线制作中丁TC还原剂的选择以往文献里,在TTC标准曲线制作中,通常以连二亚硫酸钠为还原剂,将标准TTC还原为红色TF,该方法的缺点是溶液显色极不稳定,易消失,这可能是TTC被还原成TF时,TF共扼双键被过剩的连二亚由图2可知,在波长为492nm处,一定时间内TF生成量随时间的增长而增加,但随着时间的延长,反应速度趋于平缓,在Zh时显色强度已便于检出,因此培养时间以Zh为佳。中一环像产止2(洲拓.12njnJ)交I流{平}合00nlnI0n云Cstl00PI翻nlom2.4添加不同基质的影响Kalpwjik等认为,样品中缺乏有机基质时,所测得的是内源呼吸的脱氢酶活性,而加人基质时,可测得最大基质呼吸的脱氢酶活性。本试验中参考以往文献,选择将混合基质污泥上清液和单一基质葡萄糖分别作为基质,研究不同基质的添加对脱氢酶测定结果的影响,试验结果如图3所示。表2不同萃取剂对丁F萃取效果的比较萃取剂吸光度丙酮2.412甲苯0.956正丁醉0.968一一。一加l乙渭液液___一加葡萄愉愉181石141.21.00.8和水溶液不会产生液一液分层的现象,TF会均匀地分布在水与萃取剂的混合液中。由于丙酮和水的体积比是l:1,萃取剂中的TF浓度就相当于被稀释到原来的l半,所以在这种情况下测出的吸光度应该是TF在单一丙酮溶液中的1/2,为反映这一问题,将丙酮的实测值做了相应的修正,因此本试验选择丙酮作为萃取剂。\_//ǎ石。曰\国à咧粗别LL卜,.角hZ2.助h3反应时问(h)图3添加不同基质对丁F生成t的影响由图3可知,添加葡萄糖为基质的TF的生成量远大于添加污泥上清液,这说明添加单一基质葡萄糖更能真实地测定出污泥脱氢酶的活性。2.5不同酶反应终止剂的选择Klapwijk等采用浓硫酸作为活性污泥脱氢酶活性测定的酶反应终止剂,但是在本试验中发现,加人0.smL的浓硫酸会使污泥样品培养液褪色,背景值增大,而且污泥龄较长的样品会出现茶色反应,影响吸光度的测定。当加人体积为培养液体积ll/0的甲醛作为终止剂时,则可避免“茶色现象”,终止效果优于加人浓硫酸,这说明导致污泥脱氢酶活性测定中出现“茶色现象”的原因是浓硫酸的加入,这可能与污泥的自身特性有关。由于甲醛对酶反应终止作用迅速,实际用量少,因此选用甲醛作为酶反应终止剂是合适的。.26萃取剂的确定脱氢酶与TTC生成TF,TF的颜色深说明脱氢酶活性高,因此产物萃取是很重要的一步。但目前国内外TF萃取剂的选择不统一,使TTC一脱氢酶活性测定的结果很难进行横向比较。因此本试验选择丙酮、甲苯和正丁醇三种有机物作为萃取剂进行对比,试验结果如表2所示。由表2可知,在同等条件下,10min时丙酮的萃取效果最好,吸光度最大,而甲苯和正丁醇容易引起污泥结块,影响萃取,吸光度不到丙酮的一半。这里摇说明的是,由于丙酮与水互溶,所以萃取剂3结论(l)在TTC标准曲线的制作中,用硫化钠作为还原剂,显色完全,色度稳定,吸光度长时间保持稳定,效果较好。采用甲醛作为终止剂,可避免浓硫酸的“茶色现象”,终止作用迅速,用量少。(2)样品前处理是消化污泥脱氢酶活性测定的必需步骤,用蒸馏水代替0.85%生理盐水洗涤活性污泥,可提高TF检出量。(3)在酶活性的测定中,较短的培养时间可避免酶本身的变性所带来的不良影响,在本试验的条件下培养时间为Zh时,生成的TF已利于检测。(4)添加基质会提高TF的生成量,试验表明添加单一基质葡萄糖比添加污泥上清液成分稳定,TF的生成量大,效果优于添加污泥上清液。(5)采用甲苯、正丁醇和丙酮作为萃取剂常温萃取,进行比较分析。其中丙酮与水互溶,TF会均匀地分布在水与萃取剂的混合液中,有利于TF的萃取,因此同等条件下,丙酮的萃取效果最好。参考文献:【1]金若菲,周集体,王竞等膜生物反应器中的生物学特征[、J]微生物学通报,2004,31(2):121一125【2]尹军.消化污泥脱氢酶活性检测的若干问题【习.中国给水排水2以刃.16(10):47一49【3]俞琉雌.环境工程微生物检验手朋〔M}.北京:中国环境科学出版社,}9的163一165.【4]李今,吴振斌,贺锋.生物膜活性测定中丁丁C一脱氢酶活性测定法的改进{J].吉首大学学报(自然科学版),2005,26(1)37一39【5]朱南文,阂航,陈美慈等.脱氢酶活性测定方法的探讨!月中国沼气,1996,16(2):3一6CHINAENVIRONMENTALPROTECT!ON!陇划SRTYZ以拍.12