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山东大学期末考试知识点复习第八章毛细管电泳分析法1．毛细管电泳的主要特点以毛细管为分离通道、以高压电场为驱动力的液相分离分析技术，具有高效分离、快速分析、微量进样和灵敏度高的特点，特别适合离子、大分子与生物化合物的分离分析。2．毛细管电泳仪基本组成与结构流程毛细管电泳仪主要由高压电源、缓冲液和进样系统、毛细管柱、检测．器及数据处理等五部分组成。高压电源可对毛细管施加连续可调的0～50kV直流电压，毛细管柱是电泳分离的核心部件，通常使用内径10～100μm，长12～120cm的弹性熔融石英毛细管，两端分别浸泡在含有缓冲溶液的储液槽中，出口端装有检测器。紫外可见光谱检测是最普遍的检测方法，激光诱导荧光检测是所有检测方法中灵敏度最高的，最低检出限可达10-21mol。3．毛细管电泳的进样方式电迁移(电动)进样：在很短时间内，施加电压使样品通过电迁移进入毛细管。特点：易控制进样量(控制电压和时间)，存在歧视现象，即电泳淌度大的组分进样量大。流体力学进样：进样端加压、出口端抽真空及两端形成高度差产生虹吸三种方式。特点：进样量不受样品基质的影响，不存在歧视现象，进样重复性差。4．毛细管电泳分离的基本原理在毛细管电泳分离中带电粒子的运动受到两种力的共同作用：电泳力和电渗力。电解质的电泳迁移速率山东大学期末考试知识点复习单位电场强度下的平均电泳速度，即电泳迁移率(电泳淌度μe)：E为电场强度；f为阻力系数；V为毛细管柱两端施加的电压；Rs是离子的有效半径；L为毛细管柱的长度。在pH3的水溶液中，石英或玻璃毛细管内壁表面上的硅醇基可电离而产生SiO一，使毛细管内壁带上负电荷，因此溶液中的一部分正离子，依靠静电作用而吸附于毛细管内壁上，形成一个双电层，此处的电动势称为界面电动势，也称ζ电位。在电场的作用下，固、液两相之间发生相对运动，管中溶液整体向阴极移动，形成电渗流。电渗流的大小与ζ电位成正比，电渗迁移率μeo=εζ／(4πη)式中，μeo为电渗迁移率；ε为介质的介电常数；η为介质的黏度。电渗迁移速率为电泳流的若干倍，且受pH等条件的影响很大，在分离过程中很容易发生变化，因而必须加以控制，使其在一定范围内保持恒定。电渗流(即溶剂流)的迁移速率为veo，则veo=μeoE=ζE／(4πη)毛细管中粒子的移动速度(v1)等于其电泳迁移速度(ve)与电渗流速度(veo)的矢量和：v1=ve+veo当把样品从阳极端注入毛细管时，各种离子将按下面的速度迁移到阴极：正离子：v+=ve+veo中性离子：v=veo负离子：v一=ve一veo山东大学期末考试知识点复习5．毛细管电泳的分离模式毛细管电泳的分离模式可分为电泳分离和色谱分离两类：电泳分离模式主要包括：毛细管区带电泳(CZE)；毛细管凝胶、电泳(CGE)；毛细管等速电泳(CITP)；毛细管等电聚焦(CIEF)。色谱分离模式主要包括：胶束电动毛细管色谱(MEKC)；毛细管电色谱(CEC)。6．毛细管区带电泳(CZE)CZE是毛细管电泳最基本的一种分离模式，电泳时所采用的背景电解质是缓冲液，分离是基于样品中各个组分间荷质比的差异，依靠样品中的不同离子成分在外加电场作用下电泳淌度的不同而实现分离，有时需在缓冲液中加入一定的添加剂，以提高分离选择性，改变电渗流的大小和方向或抑制毛细管壁的吸附等。7．胶束电动毛细管色谱(MEKC)MEKC是毛细管电泳中唯一既能分离中性化合物又能分离带电组分的分离模式。在背景电解质中加入超过临界胶束浓度的表面活性剂，使之在溶液中形成胶束，在电泳中，这些胶束按其所带电荷的不同朝着与电渗流：EOF相同或相反的方向迁移，作为一种“假固定相”，使样品组分在受电场作用的同时，又能在背景电解质和此“假固定相”之间进行分配，依据其电泳淌度和分配行为的不同而进行分离。8．毛细管电色谱(CEC)CEC主要是基于色谱分离机制而进行分离的电泳技术，它在毛细管中填充了液相色谱用固定相载体，使被分离组分在这些载体上进行保留和分配。它与液相色谱技术的区别在于前者以电渗流为驱动力，后者以压力为驱动力。9．毛细管等电聚焦(CIEF)CIEF是依据样品组分的等电点不同而实现分离的一种电泳技术。分离时需将待分离的两性化合物与能在毛细管内形成一定pH梯度的两性电解质同时山东大学期末考试知识点复习引入毛细管，并以酸性溶液作为阳极缓冲液，碱性溶液作阴极缓冲液，施加电场后，两性电解质能在一定的pH范围内迅速建立起稳定的pH梯度，与此同时，具有不同的PI(等电点)的两性组分开始聚焦，即在电场作用下，向着pH＝PI处移动，在该处两性组分呈电中性，停止移动，形成窄溶质带而相互分离；聚焦完成后通过向毛细管一端施加压力或在电极槽中加入电解质破坏已形成的pH梯度，使样品重新带电，在电场作用下发生迁移，进行检测。电渗流在CIEF中不利，应消除或减小。10．毛细管等速电泳(CITP)CITP的分离机理也是依据样品组分电泳淌度的不同来进行分离，使用两种电解质，一种为前导电解质，含有比所有组分电泳淌度都大的前导离子，另一种是尾随电解质，含有比所有组分电泳淌度都小的尾随离子，样品组分在两种电解质界面中间，施加电场后，样品组分夹在前导离子和尾随离子间移动，并逐步分离。当达到电泳稳定时，各组分按其淌度的大小依次相连，并都以前导离子相同的速度移动，故称为等速电泳。11．毛细管凝胶电泳(CGE)将聚丙烯酰胺等在毛细管柱内交联生成凝胶，其具有多孔性，样品组分在分离中不仅受电场力的作用还受到凝胶的尺寸排阻效应的作用，可使试样分子按大小分离，并能够有效减小组分扩散，所得峰型尖锐，CGE具有很高的分离效率，理论塔板数n10’。蛋白质、DNA等的荷质比与分子大小无关，CZE模式很难分离，采用CGE能获得良好分离。特点：抗对流性好，散热性好，分离度极高。12．毛细管电泳的分离效率和分辨率毛细管电泳分离柱效方程为山东大学期末考试知识点复习提高分离电压是增加分离效率的主要途径。扩散系数小的溶质比扩散系数大的分离效率高，这也是毛细管电泳可用来高效分离生物大分子的依据。分辨率提高分辨率的途径：增大分离电压和控制电渗流。13．毛细管电泳分离中电场强度与温度的影响电渗流速度和电场强度成正比，当毛细管长度一定时，电渗流速度正比于工作电压。施加的分离电压越高，分辨率越大。根据欧姆定律，电压与电流呈线性关系，在熔凝毛细管中产生的热量与电流的平方成正比，如果产生的焦耳热(毛细管溶液中有电流通过时，产生的热量)不能及时通过管壁向周围环境散去，将使毛细管内温度升高，溶液的黏度下降，电渗流增大。同时引起区带展宽，使柱效、分辨率降低。降低温度影响的方法改善方法：①减小毛细管内径；②控制散热；14．毛细管电泳中的电解效应及缓冲溶液的选择电泳分离过程的高电压易造成两端电极上电解反应发生，其结果阳极端因OH-被消耗而H+量相对增加，阴极端则因消耗H+而使OH一量相对增加。通电时间越长，电流越大，H+或OH一的增量就越大，两极溶液的。pH差距也就越大。试样组分的泳流速度受电渗流影响很大，而电渗流则受溶液的pH影响很大。因此，进行毛细管电泳时，必须使用均一的、具有pH缓冲能力的溶液为分离介质。电渗流与毛细管内表面与电解质溶液间形成的双电层有关，当缓冲溶液浓度(或离子强度)增加时，双电层的厚度降低，ζ电位减小，溶液的黏度增大，电渗山东大学期末考试知识点复习流速度将减小。随着缓冲溶液浓度增加，电渗效应减小，分辨率增加。不过使用过高浓度的电解质容易导致溶液过热，会引起电泳区带展宽，使分辨率降低。15．毛细管电泳分析的重要应用手性分离；糖及蛋白质分析；DNA及其片段分析；大细胞分离；特殊样品中离子化合物分析等。