N比异养硝化好氧反硝化菌筛选及硝化特性

化工进展CHEMICALINDUSTRYANDENGINEERINGPROGRESS2019年第38卷第3期低C/N比异养硝化-好氧反硝化菌筛选及硝化特性胡杰1，颜家保1，霍晓琼2，陈美玲1，李超1（1武汉科技大学化学与化工学院，煤转化与新型炭材料湖北省重点实验室，湖北武汉430081；2大长江环境工程技术有限责任公司，湖南长沙410199）摘要：针对生物法处理低C/N比废水存在碳源不足、脱氮效率不高问题，从石化废水处理厂活性污泥中分离得到一株低C/N比异养硝化-好氧反硝化菌株WUST-7。通过形态学观察、生理生化试验和16SrDNA序列分析，鉴定其为假单胞菌属（Pseudomonassp.）。通过单因素实验，考察碳源种类、培养温度、初始pH和摇床转速对菌株硝化性能的影响，确定最优异养硝化培养条件为：丁二酸钠为碳源、培养温度30～35℃、初始pH8.0～9.0、摇床转速150～200r/min。在最优异养硝化条件下培养9h，可将初始浓度为107.52mg/L的氨氮去除90.64%，并且在整个培养过程中没有亚硝酸盐氮的积累，硝酸盐氮含量也始终低于3.5mg/L，总氮的去除率达88.63%。实验结果表明，菌株WUST-7在利用氨氮进行硝化反应的同时，还可以利用硝酸盐氮进行反硝化，具有良好的同步硝化反硝化潜能。关键词：废水；异养硝化；好氧反硝化；低C/N比；同步硝化反硝化中图分类号：X703文献标志码：A文章编号：1000-6613（2019）03-1567-06Screeningandnitrificationcharacteristicsofheterotrophicnitrification-aerobicdenitrificationbacteriawithlowC/NratioHUJie1，YANJiabao1，HUOXiaoqiong2，CHENMeiling1，LIChao1(1HubeiProvincekeyLaboratoryofCoalConversionandNewCarbonMaterials,SchoolofChemistryandChemicalEngineering,WuhanUniversityofScienceandTechnology,Wuhan430081,Hubei,China;2DaChangjiangEnvironmentalEngineeringTechnologyCo.,Ltd.,Changsha410199,Hunan,China)Abstract:InviewoftheproblemsofinsufficientcarbonsourceandlownitrogenremovalefficiencyforbiologicaltreatmentoflowC/Nratiowastewater,aheterotrophicnitrification-aerobicdenitrificationstrainWUST-7withlowC/Nratiowasisolatedfromtheactivatedsludgeofpetrochemicalwastewatertreatmentplant.Pseudomonassp.wasidentifiedbymorphologicalobservation,physiologicalandbiochemicaltestsand16SrDNAsequenceanalysis.Theeffectsofcarbonsourcetype,culturetemperature,initialpHandrotationspeedonthenitrificationcharacteristicswereinvestigatedbysinglefactorexperiments.Theoptimalconditionsforheterotrophicnitrificationweredeterminedasfollows:sodiumsuccinateascarbonsource,culturetemperature30－35℃,initialpH8.0－9.0,rotationspeed150－200r/min.Undertheoptimalcultureconditionsfor9h,90.64%ofammonianitrogenwithinitialconcentrationof107.52mg/Lcouldberemovedtherewasnoaccumulationofnitritenitrogenandthenitratenitrogencontentwas􀤕􀤕􀤕􀤕􀦕􀤕􀦕􀤕􀤕􀤕􀤕􀦕􀤕􀦕应用技术DOI：10.16085/j.issn.1000-6613.2018-0952收稿日期：2018-05-09；修改稿日期：2018-07-02。基金项目：湖北省科技创新专项重大项目（2017ACA179）。第一作者：胡杰（1993—），男，硕士研究生，研究方向为水处理及环境微生物。E-mail：[e-mail]。通信作者：颜家保，教授，博士生导师，研究方向为废水生物强化及深度处理。E-mail：[e-mail]。引用本文：胡杰,颜家保,霍晓琼,等.低C/N比异养硝化-好氧反硝化菌筛选及硝化特性[J].化工进展,2019,38(3):1567-1572.Citation：HUJie,YANJiabao,HUOXiaoqiong,etal.Screeningandnitrificationcharacteristicsofheterotrophicnitrification-aerobicdenitrificationbacteriawithlowC/Nratio[J].ChemicalIndustryandEngineeringProgress,2019,38(3):1567-1572.··1567化工进展2019年第38卷alwayslowerthan3.5mg/Linthewholeprocess.Theremovalrateoftotalnitrogenisupto88.63%.TheexperimentalresultsshowedthatthestrainWUST-7hadgoodsimultaneousnitrificationanddenitrificationpotentialwhenitusedammonianitrogenfornitrificationandnitratenitrogenfordenitrification.Keywords:wastewater;heterotrophicnitrification;aerobicdenitrification;lowC/Nratio;simultaneousnitrificationanddenitrification随着水体富营养化问题日益突出，国家对废水中氨氮和总氮排放要求越来越严格，如何经济有效脱氮成为废水处理领域研究热点。目前常规废水脱氮还是采用生物法，但由于其硝化和反硝化过程分开进行，使得处理工艺长、占地面积大、基建投资高[1-2]。近年来，国内外研究者陆续发现了一些新型脱氮菌株，这些菌株在进行硝化反应同时，还可以进行反硝化[3]，包括Alcaligenesfaecalis[1-2,4]、Diaphorobactersp.[5]、Acinetobacterjunii.[6]、Aeromonassp.[7]、Pseudomonassp.[8-10]等，这就使得硝化和反硝化在同一反应器、同一条件下进行成为可能。但是这些菌株均为异养菌，在进行硝化和反硝化过程中，均需要消耗有机碳源。而且实际废水脱氮过程是一个混菌体系，部分碳源会被其他异养微生物消耗[2]，这样无疑增加了废水中有机碳源的需求。而我国化工废水、养殖废水、垃圾渗滤液及部分城市生活污水的C/N比都比较低[11]，实际处理过程中，通常是投加有机碳源来提高C/N比以实现氮的高效去除，这样不仅增加了废水处理费用，而且会增大温室气体排放量，污染环境。基于此，本研究从石化废水处理厂活性污泥中分离得到一株低C/N比异养硝化-好氧反硝化高效菌，并对其进行种属鉴定及硝化特性研究，考察环境因素对氨氮脱除性能的影响，确定氮的代谢情况及变化规律，为低C/N比废水高效脱氮提供理论依据和技术参考。1实验材料与方法1.1实验材料菌源：取自武汉石化炼油废水处理系统活性污泥。LB培养基：酵母提取物5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl10g/L，pH为7.2～7.4。异养硝化培养基：丁二酸钠6.136g/L，Na2HPO4·12H2O8.0g/L，KH2PO41.5g/L，(NH4)2SO40.50g/L，MgSO4·7H2O0.1g/L，FeSO4·7H2O0.01g/L，微量元素储备液2mL。好氧反硝化培养基：用0.75g/LKNO3代替(NH4)2SO4作为氮源，其余同异养硝化培养基。微量元素储备液：MnSO4·4H2O0.10g/L，ZnSO4·7H2O0.12g/L，H3BO30.07g/L，Na2MoO4·2H2O0.04g/L，CuSO4·5H2O0.02g/L，CoCl·6H2O0.04g/L。所用培养基均在121℃条件下高压蒸汽灭菌30min，向各液体培养基中加入15~20g/L琼脂粉即可制成相应固体培养基。1.2实验方法1.2.1菌株驯化和分离取少量新鲜菌源于100mLLB培养基中活化、富集2次后，转接至异养硝化和好氧反硝化培养基中多次驯化，过程中依次调节C/N比为12、10、8、6。将驯化完的菌液通过稀释涂平板和平板划线法分离，得到多株同时具有异养硝化-好氧反硝化性能的菌株。1.2.2菌株筛选和鉴定对分离得到的菌株进行低C/N比（C/N=6）异养硝化和好氧反硝化性能测定，选取其中硝化和反硝化综合性能最优的菌株作为优势菌，依据《常见细菌系统鉴定手册》进行形态学观察及生理生化试验[12]，并进行基因组DNA的提取及16SrDNA的测序。1.2.3异养硝化条件选择及脱氮特性将优势菌以3%（体积分数）的接种量接入C/N比为6、初始氨氮浓度为100mg/L左右的异养硝化培养基中，通过单因素实验分析碳源种类、培养温度、初始pH和摇床转速对硝化性能的影响，确定最优异养硝化培养条件。并在最优异养硝化培养条件下，测定培养基中氨氮、亚硝酸盐氮、硝酸盐氮和总氮含量，分析培养基中氮的代谢情况及变化规律。··1568第3期胡杰等：低C/N比异养硝化-好氧反硝化菌筛选及硝化特性1.3分析方法氨氮测定采用纳氏试剂光度法，硝酸盐氮测定采用酚二磺酸光度法，亚硝酸盐氮测定采用N-(1-萘基)-乙二胺光度法，总氮测定采用过硫酸钾氧化紫外分光光度法[13]。2实验结果与讨论2.1菌种鉴定2.1.1形态学观察与生理生化试验经分离纯化，得到17株低C/N比异养硝化-好氧反硝化菌株，选取其中硝化和反硝化性能最好的一株，命名为WUST-7，进行后续研究。图1为WUST-7的菌落形态及革兰氏染色图片，可以看出WUST-7的菌落呈圆形，乳白色，不透明，表面光滑，边缘整齐，革兰氏染色呈阴性。生理生化试验结果表明：硝酸盐还原试验、甲基红试验、淀粉水解试验和糖酵解试验呈阳性；吲哚试验、V-P试验、明胶液化试验呈阴性。通过形态学观察及生理生化试验结果，初步推断WUST-7为假单胞菌属（Pseudomonassp.）。2.1.2分子生物学鉴定对WUST-7进行16SrDNA测序，得到长为1431bp的碱基序列，将其输入到GenBank数据库中进行Blast比对，与WUST-7同源性最高的为PseudomonasmendocinastrainATCC25411（99%）。利用MEGA7.0软件计算系统进化距离，构建系统发育树，如图2所示，可以看出，在进化过程中，与WUST-7亲缘关系最近的主要为假单胞菌属（Pseudomonassp