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周俊宜基础医学院生化教研室目录PCR技术简史PCR的原理PCR的反应体系和方法PCR的类型和应用PCR技术简史•DNA的复制•核酸体外扩增的设想•聚合酶链反应的发明ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC5’3’TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG3’5’解旋酶解链酶DNA解旋解链合成引物子链延长PCR技术简史•DNA的复制•核酸体外扩增的设想•聚合酶链反应的发明ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC5’3’TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG3’5’DNA解旋解链合成引物子链延长GGAUCG5‘AUCGCG5‘TAGCGCTATCGCATCGACGCT3’ATAGCGTAGCTGCGAGGATCG3’DNA聚合酶DNA聚合酶PCR技术简史•DNA的复制•核酸体外扩增的设想•聚合酶链反应的发明•1971年，Khorana提出：经过DNA变性，与合适引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可克隆tRNA基因。•但由于测序和引物合成的困难，以及70年代基因工程技术的发明使克隆基因成为可能，所以，Khorana的设想被人们遗忘了……PCR技术简史•DNA的复制•核酸体外扩增的设想•聚合酶链反应的发明•1985年，美国PE-Cetus公司的Mullis等人发明了聚合酶链反应（PCR）•基本原理是在试管中模拟细胞内的DNA复制•最初采用E-coliDNA聚合酶进行PCR，由于该酶不耐热，使这一过程耗时，费力，且易出错•耐热DNA聚合酶的应用使得PCR能高效率的进行，随后PE-Cetus公司推出了第一台PCR自动化热循环仪•1993年，Mullis等因此项技术获诺贝尔化学奖KaryB.MullisTheUnusualOriginofthePolymeraseChainReaction1989年美国《Science》杂志列PCR为十余项重大科学发明之首,比喻1989年为PCR爆炸年,Mullis荣获1993年度诺贝尔化学奖。生物样品DNA片段基因诊断基因治疗基因工程产品法医学检测人类学研究……基因组DNA获取特定DNA片段扩增特定DNA片段DNA聚合酶引物引物M13噬菌体Sanger的测序技术引物DNA聚合酶引物引物Mullis的构思DNA聚合酶DNA聚合酶特定DNA片段94℃变性50-65℃退火XX℃延伸94℃55℃37℃TaqDNA聚合酶（thermusaquaticus)酶活性(%)温度(℃)4050607080901001008060402072℃94℃55℃PCR循环PCR的基本原理•PCR反应条件•PCR过程•PCR的特点标准的PCR反应体系4种dNTP混合物各200umol/L引物各10～100pmol模板DNA0.1～2ugTaqDNA聚合酶2.5uMg2+1.5mmol/L1234522557294时间（min）温度（℃）PCR的基本原理•PCR反应条件•PCR过程•PCR的特点适温延伸3高温变性1低温退火2重复1~3步25~30轮目的DNA片段扩增100万倍以上DNA双螺旋DNA单链与引物复性DNA变性形成2条单链子链延伸DNA加倍PCR的基本原理•PCR反应条件•PCR过程•PCR的特点1234522557294时间（min）温度（℃）适温延伸3高温变性1低温退火2重复1~3步25~30轮目的DNA片段扩增100万倍以上DNA双螺旋DNA单链与引物复性子链延伸DNA加倍DNA变性形成2条单链模板DNA95℃PCR的基本原理•PCR反应条件•PCR过程•PCR的特点95℃50℃引物1引物2DNA引物PCR的基本原理•PCR反应条件•PCR过程•PCR的特点50℃引物1引物2DNA引物72℃Taq酶Taq酶PCR的基本原理•PCR反应条件•PCR过程•PCR的特点72℃第1轮结束95℃第2轮开始PCR的基本原理•PCR反应条件•PCR过程•PCR的特点95℃50℃72℃TaqTaqTaqTaqPCR的基本原理•PCR反应条件•PCR过程•PCR的特点95℃50℃72℃TaqTaqTaqTaqPCR的基本原理•PCR反应条件•PCR过程•PCR的特点72℃第2轮结束PCR的基本原理•PCR反应条件•PCR过程•PCR的特点模板DNA第1轮扩增第2轮扩增第3轮扩增第4轮扩增第5轮扩增第6轮扩增PCR的基本原理•PCR反应条件•PCR过程•PCR的特点•灵敏度高1.皮克(pg=10-12)量级扩增到微克(ug=10-6)水平2.能从100万个细胞中检出一个靶细胞3.病毒检测的灵敏度可达3个RFU4.细菌检测的最小检出率为3个细菌•简便、快速1.一次性加好反应液，2～4小时完成扩增2.扩增产物一般用电泳分析•对标本的纯度要求低血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等组织的粗提DNA引物设计：（1)序列应位于高度保守区，与非扩增区无同源序列。（2）引物长度以15-40bp为宜。（3）碱基尽可能随机分布，G+C占50-60%。（4）引物内部避免形成二级结构。（5）两引物间避免有互补序列。（6）引物3’端为关键碱基；5’端无严格限制。3’5’3’5’限制性内切酶的识别序列启动子序列定点突变探针标记1）PCR反应成分（1）模板单、双链DNA均可。不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制剂、DNA结合蛋白类。一般100ngDNA模板/100L。模板浓度过高会导致反应的非特异性增加。PCR反应条件（2）引物浓度0.1-0.5mol/L浓度过高易导致模板与引物错配,反应特异性下降。（3）TaqDNA聚合酶（thermusaquaticus)0.5-2.5U/50l酶量增加使反应特异性下降;酶量过少影响反应产量。（4）dNTPdNTP浓度取决于扩增片段的长度四种dNTP浓度应相等浓度过高易产生错误碱基的掺入，浓度过低则降低反应产量dNTP可与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度下降，影响DNA聚合酶的活性。（5）Mg2+Mg2+是DNA聚合酶的激活剂。0.5mmol/L-2.5mmol/L反应体系。Mg2+浓度过低会使Taq酶活性丧失、PCR产量下降；Mg2+过高影响反应特异性。Mg2+可与负离子结合，所以反应体系中dNTP、EDTA等的浓度影响反应中游离的Mg2+浓度。2）循环参数(1)变性使双链DNA解链为单链95oC20-30秒(2)退火温度由引物长度和GC含量决定。增加温度能减少引物与模板的非特异性结合;降低温度可增加反应的灵敏性。（3）延伸70-75oC，延伸时间由扩增片段长度决定（4）循环次数主要取决于模版DNA的浓度一般为25-35次次数过多：扩增效率降低错误掺入率增加PCR的类型和应用•研究–基因克隆，DNA测序，分析突变•诊断–细菌、病毒、寄生虫检测，诊断•人类基因组工程–遗传图谱的构建，DNA测序，表达图谱•法医–犯罪现场标本分析•肿瘤–各种肿瘤检测•其他……1）不对称PCR目的：扩增产生特异长度的单链DNA。方法：采用两种不同浓度的引物。分别称为限制性引物和非限制性引物,其最佳比例一般是0.01∶0.5μM,关键是限制性引物的绝对量。用途：制备核酸序列测定的模板制备杂交探针基因组DNA结构功能的研究高浓度引物低浓度引物2)反向PCR(reversePCR)是用反向的互补引物来扩增两引物以外的DNA片段对某个已知DNA片段两侧的未知序列进行扩增。可对未知序列扩增后进行分析,如探索邻接已知DNA片段的序列；用于仅知部分序列的全长cDNA的克隆,扩增基因文库的插入DNA；建立基因组步移文库。已知序列未知序列未知序列已知序列未知序列未知序列限制酶限制酶连接酶3）多重PCR用于检测特定基因序列的存在或缺失。电泳引物4）LP-PCR（Labelledprimers)利用同位素、荧光素等对ＰＣＲ引物进行标记，用以直观地检测目的基因。特别适合大量临床标本的基因诊断可同时检测多种基因成分病毒1病毒2病毒3病毒4标记引物ＰＣＲ观察PCR产物5）锚式PCR已知靶基因片段两测的序列VHCH1CH1CH2CH2CH3CH3VHVLVLCLCLcDNA末端核酸转移酶3’GG…GG5’CC…CC锚定引物3’GG…GG5’CC…CC3’GG…GGCC…CC6）PCR固相分析法模板生物素化引物PCR扩增探针亲和固相介质检测探针信号7）原位ＰＣＲ原位聚合酶链式反应（InStillPCR，Is－PCR）是由Haase等于1990年首创。它是利用完整的细胞作为一个微小的反应体系来扩增细胞内的目的片段，在不破坏细胞的前提下，利用一些特定的检测手段来检测细胞内的扩增产物。直接用细胞涂片或石蜡包埋组织切片在单个细胞中进行ＰＣＲ扩增。可进行细胞内定位。适用于检测病理切片中含量较少的靶序列操作步骤细胞或组织的固定PCR扩增细胞内目的片段原位杂交检测扩增产物人类染色体端粒DNA的荧光原位杂交照片8）ＲＴ－ＰＣＲ逆转录酶ＤＮＡ聚合酶mRNAcDNA杂化双链PCR扩增基因mRNA蛋白质多肽链实时PCR技术原理PCR技术的应用1)基因克隆重组DNA质粒DNA基因片段5’5’BamHIBamHIBamHIBamHIGTCCGGACCCTGCAGGGTCCGGACCCTGCAGGCCTGGGACGTCCCAGG质粒DNA目的基因限制性核酸内切酶2)基因检测A’内源性病变基因正常人A病人病原微生物基因正常人(-)病人(+)遗传病的诊断基因缺失、插入或置换等地中海贫血珠蛋白链合成不平衡A正常人病人正常病人ASO探针法ACTGASO探针正常病人探针杂交NC膜探针正常人突变纯合子突变杂合子PCR-RFLP法：限制性内切酶恶性肿瘤（癌基因或抑癌基因）Ras基因突变限制性内切酶正常突变电泳HLA系统基因分型PCR-RFLP法PCR-SSO法PCR-SSCPPCR-SSP3)基因配型PCR-SSP12345678PCR12345678引物特异性4）基因鉴定女性男性Y引物PCR男性女性法医学分析个体识别、亲缘鉴定方法：PCR-RFLPDNA遗传指纹PCR-ASOPCR-VNTR多态性PCR-SSCP线粒体DNA测序PCR-VNTR多态性检测PCR；电泳检测父’父子母现嫌1嫌2嫌3