PCRDGGE技术分析塔式蚯蚓生态滤池微生物群落结构

中国环境科学2011,31(4)：597~602ChinaEnvironmentalSciencePCR-DGGE技术分析塔式蚯蚓生态滤池微生物群落结构郭飞宏1,郑正2*,张继彪2(1.南京大学环境学院,污染控制与资源化研究国家重点实验室,江苏南京210093；2.复旦大学环境科学与工程系,上海200433)摘要：利用PCR-DGGE技术研究塔式蚯蚓生态滤池微生物群落结构变化,结果表明,微生物的变化与滤池体积大小、水力停留时间和污染物负荷有关,微生物群落结构在不同滤池层中变化较大.12个样品泳道中的总细菌的Shannon-Wiener多样性指数从0.25变化到1.27,一级滤池微生物多样性指数从0.29变化到1.05,二级滤池微生物多样性指数从0.75变化到0.97,三级滤池微生物多样性指数先从0.87减少到0.25,后由于葡萄糖的加入增加到1.27.二级滤池出水中葡萄糖的加入,加强了系统内微生物的活性,从而三级滤池砂石和青石层细菌条带变亮变多.经过克隆测序和系统发育树分析,塔式蚯蚓生态滤池内的微生物多为单细胞菌属、假单细胞菌属、革兰氏阴性菌属和不可培养杆菌属,不同细菌条带在不同级滤池内差异变化明显.关键词：PCR-DGGE；蚯蚓生态滤池；微生物群落；指数；菌属中图分类号：X705文献标识码：A文章编号：1000-6923(2011)04-0597-06Researchonmicrobecommunityintowerearthwormecology-filterbyPCR-DGGE.GUOFei-hong1,ZHENGZheng2*,ZHANGJi-biao2(1.StateKeyLaboratoryofPollutionControlandResourceReuse,SchooloftheEnvironment,NanjingUniversity,Nanjing210093,China；2.DepartmentofEnvironmentalScienceandEngineering,FudanUniversity,Shanghai200433,China).ChinaEnvironmentalScience,2011,31(4)：597~602Abstract：Changeofmicrobecommunityintowerearthwormecology-filterwasstudiedinthisresearchwithPCR-DGGEtechnology(polymerasechainreaction-denaturinggradientgelelectrophoresis).Theseresultsshowedthat:thechangeofmicrobecommunitywasobviousandlinkedwithhydraulicresidenttime、pollutationburdenandthevolumeoffilters.Meanwhile,Shannon-WienerIndexofbiodiversityincreasedfrom0.25to1.27inanall-roundway,including0.29～1.05inthefirstfilter,0.75~0.97inthesecondfilterand0.87~0.25~1.27causedbysomeglucoseaddedintoinfluentinthelastfilter.Underthesamereason,theactivityandlightofdenitrifyingbacteriawereintensifiedonbluestoneandgravellayers.Afteranalysisofcloningsequencingandphylogenetictree,mostoftheinferredbacteriawereSphingomonas,Pseudomonas,Gram-negativebacteriaandunculturedBacillusandchangedevidentlyindifferentfilters.Keywords：PCR-DGGE；earthwormecology-filter；microbecommunity；index；bacteria塔式蚯蚓生态滤池是利用蚯蚓能够提高土壤通气性能和促进有机物分解而设计的一种新型污水处理工艺,它充分利用了植物、动物和微生物的协同作用,相比传统污水处理工艺具有投资省、处理效率高、无污泥产生等优点[1].“蚯蚓”在该系统对污染物降解中的作用:一是去除污水中的有机物,二是提高土壤通气性活化土壤,从而加大土壤富氧程度,间接促进系统内的耗氧微生物的活性.但是塔式蚯蚓滤池内部结构复杂,以往的研究主要集中在进水、出水等外部影响因素上,没有对塔式蚯蚓生态滤池内部微生物群落结构[1]进行研究,使得对污水处理过程中微生物与处理效果关系性的研究仍处于“黑盒子”状态.传统的微生物生态学研究是基于微生物的直接培养来分析环境中微生物的种群结构及其生态关系的,由于自然界中可培养微生物数量占实际微生物数量不足10%,传统方法显然不适合微生物群体结构研究.PCR-DGGE技术不经过分离培养技术而直接对环境微生物进行分析,克服了传统微生物分类鉴定法的不足,可以直接可靠收稿日期：2010-07-10基金项目：国家水体污染控制与治理科技重大专项(2008ZX07101-004)*责任作者,教授,[e-mail]598中国环境科学31卷的反映出微生物的多样性[2].本研究利用PCR-DGGE技术,以实验平台上运行1年的塔式蚯蚓生态滤池为研究对象,考察了三级塔式蚯蚓生态滤池中的微生物群落的演变.旨在为工艺运行和滤池内微生物的动态变化之间架起一座沟通桥梁,根据测得的滤池内微生物群落结构确定优势菌群进而调节工艺参数提高污水处理效率.1材料与方法1.1塔式蚯蚓生态滤池塔式蚯蚓生态滤池构建于2009年2月中旬,共有三级:一级、二级的尺寸(长×宽×高)0.5m×0.5m×0.6m,三级的尺寸1.1m×0.65m×1.2m.每级滤池填料包括土壤、细砂、碎青石和鹅卵石,土壤表面均栽种吊钟柳起到二次布水作用.实验使用的大平2号蚯蚓属于赤子爱胜蚯蚓,主要分布在土壤表层土和中层土中,蚯蚓在土壤中的接种密度为4.63g/L.进水为南京大学学生宿舍化粪池出水,采用蠕动泵控制进行间歇进水.水力负荷0.25m3/(m2⋅d),每天进水6h进水与落干的时间(即湿干比)为1:3.生活污水首先进入厌氧池,经过一段时间的厌氧硝化作用,部分污染物质得到降解.厌氧池中的出水通过水泵的作用,分别进入到一级滤池、二级滤池和三级滤池.污染物在多级滤料、蚯蚓和植物的共同作用下得到去除,三级滤池的出水达到国家污水排放的一级A标准.一级二级三级葡萄糖卵石层土壤层砂石层青石层厌氧池水泵集水区图1塔式蚯蚓生态滤池的结构Fig.1Structurediagramoftowerearthwormecology-filter1.2样品采集分别于2009年11月和2010年6月从塔式蚯蚓生态滤池土壤层和砂石层取样.其中一级、二级滤池取样3份,分别是土壤表层土、中层土和砂石层,三级滤池取样6份分别是:土壤表层土、表层下5cm土、中层土、下层土、砂石层和青石层.所有样品经冷冻干燥仪-80℃冻干后,研磨后过100目塞,样品分装放在-20℃保存待分析[3].1.3主要试剂TE缓冲液、二溴乙锭染色剂、1×TAE均为自制,TaqDNA聚合酶和10×Buffer购自宝生物工程(大连)有限公司,扩增引物由上海生工生物工程技术有限公司合成,超纯水用Millipore公司的Simpicity型超纯水机制成,琼脂糖购自上海生工有限公司,dNTPs和PCR产物DNAMaker购自宝生物工程(大连)有限公司.1.4实验方法1.4.1基因组DNA的提取,DNA的提取采用MOBIO公司的UltraCleanSoilDNAisolationKIT试剂盒,包括BeadSolutionTubes、2mlCollectionTubes、SpinFilterUnitsin2mlTubes、4期郭飞宏等：PCR-DGGE技术分析塔式蚯蚓生态滤池微生物群落结构599IRSsolution、SolutionS1、SolutionS2、SolutionS3、SolutionS4、SolutionS5[4].1.4.2巢式PCR扩增,利用16SrDNAV3区引物对样品DNA进行巢式PCR扩增,设计的引物为63F和1387R(一次PCR),338F-GC和518R(二次PCR).一次PCR扩增条件为94℃预变性5min,然后94℃变性45s,55℃退火1min,72℃延伸45s共30个循环,最后在72℃下延伸10min.二次PCR扩增条件为95℃预变性10min,然后95℃变性1min,63℃退火2min,72℃延伸1min共30个循环,最后在72℃下延伸10min.采用50μL的反应体系,组成为:1μL的DNA模板,4μL的MgCl2,5μL的10×PCRbuffer(Mg2+Free),4μL的dNTPs,1μL每种引物,0.25μL的Taq酶,其余用无菌超纯水补足至50μL.扩增产物用1.2%的琼脂糖凝胶电泳进行检测[5].1.4.3PCR产物的DGGE分析,制备变性剂尿素浓度梯度50%～80%,丙烯酰胺凝胶浓度为10%的变性梯度凝胶电泳(DGGE),电泳电压100V,电泳时间14h,二溴乙锭染色15min,脱色25min,图像在观测仪中拍照存档[6].1.4.4Shannon-Wiener指数分析,应用凝胶分析软件QuantityOne对扫描所得的DGGE图谱进行分析,并利用Shannon多样性指数来评价样品的微生物多样性.多样性指数经过长期试验和推导,得出公式:()()11log/log/ssiiiiiiHPPnNnN===−=−∑∑式中:Pi=ni/N;ni为峰面积;N为所有峰的总面积.2结果2.1总细菌的DGGE图谱总细菌的DGGE图谱如图2所示总共12个样品泳道,对2009年11月和2010年6月2次取样样品DGGE图谱进行了比较对比,图2是图谱效果较好的一组(2009年11月).从右往左依次为一级滤池表层土B1、中层土B2、砂石B3,二级滤池表层土B4、中层土B5、砂石B6,三级滤池表层土B7、表层5cm下土B8、中层土B9、下层土B10、砂石B11和碎青石B12.12条样品泳道均有丰富的条带,且差异性显著,其中既有一直保持数量稳定的优势菌种,又有经过一、二级滤池逐渐培养起来的优势菌种,还有经过多层滤池数量变化较大的菌种.这说明不同滤池内部细菌总群数量丰富,在处理生活污水的过程中优势菌种充分发挥了作用.abcdgh图2塔式蚯蚓生态滤池总细菌DGGE分离图谱Fig.2DiagramofDGGEpatternintowerearthwormecology-filter2.2总细菌Shannon-Wiener指数分析蚯蚓生态滤池总细菌的Shannon-Wiener多样性指数分析见表1,不同级滤池的生物多样性差别比较大,这主要与样品所处的滤池级数和在同一滤池中所处的位置有关.2.3总细菌片段克隆测序分析和菌种测定将总细菌DGGE中的部分优势条带进行割胶、克隆、测序分析,在Genbank中进行比对获600中国环境科学31卷得各优势序列的同源性信息结果见表2,细菌系统发育树如图3.3分析与讨论3.1总细菌DGGE图谱分析3.1.1从滤池角度分析一级、二级滤池泳道内细菌条带强弱变化小,数量保持稳定;三级滤池泳道内细菌变化幅度大、条带强弱差异显著,其中砂石层、青石层泳道内的细菌数量和条带亮度远优于其他泳道.这主要是由于污水首先进入一级和二级滤池,大部分污染物质被去除.但前两级滤池本身体积小,水力停留时间短,细菌代谢较快,差异性不是很明显.三级滤池体积比较大,水力停留时