PCRDGGE技术在厌氧反应器中的应用陈玉霞

第39卷第12期辽宁化工Vol.39，No.122010年12月LiaoningChemicalIndustryDecember，2010基金项目：国家自然科学基金资助项目，项目号：50978118。收稿日期：2010-11-01作者简介：陈玉霞（1957-），女，实验师，内蒙古自治区乌兰浩特人，现从事信息教育工作。E-mail：[e-mail]。通讯作者：林英姿（1968-），女，教授，博士，从事水污染控制及资源化利用研究工作。E-mail：[e-mail]，电话：[phone]。PCR-DGGE技术在厌氧反应器中的应用陈玉霞1，李庆亮2,3，林英姿2,3，姜明基2,3（1.吉林建筑工程学院继续教育学院，吉林长春130118；2.吉林建筑工程学院市政与环境工程学院，吉林长春130118；3.吉林建筑工程学院水污染控制与资源化利用吉林省重点实验室，吉林长春130021）摘要：PCR-DGGE技术是现代分子生物学技术中一种很重要的分析手段，近年来在环境微生物领域发展迅速，与传统微生物培养鉴定方法相比，PCR-DGGE技术简便、快速、准确，并且对于难以培养的微生物也具有较好的分离效果，因此，在环境微生物领域中受到普遍重视。介绍了PCR-DGGE技术的基本原理、影响因素，以及在厌氧反应器中的应用，并对其应用前景做了展望。关键词：PCR-DGGE；厌氧反应器；分子生物学中图分类号：X703文献标识码：A文章编号：1004-0935（2010）12-1263-03厌氧生物处理技术是利用厌氧微生物的代谢特性分解有机污染物，在不需要提供外源能量的条件下，以被还原有机物作为受氢体，同时产生有能源价值的甲烷气体的一种清洁高效的水处理技术[1-2]。定量和定性描述厌氧反应器中的微生物群落变化对于研究厌氧反应器的机理具有很强的指导意义，同时，厌氧反应器的研究难点也在于此，长期以来，人们大多采用传统的分离纯化培养技术来研究环境微生物，但是可分离的环境微生物种类非常少，而且在实验室中很难模拟微生物生长繁殖的自然条件，尤其是厌氧微生物，培养难度大，多样性信息更是难以获得，基于传统技术的种种局限，现在分子生物学技术能从DNA分子的角度全面准确的描述微生物的种类与数量，获得丰富的微生物多样性信息，成为人们研究环境微生物的有效技术手段。在现代分子生物学技术中，变性梯度凝胶电泳（DenaturingGradientGelElectrophoresis，DGGE）技术具有可重复、快速和操作简便等优点，目前已经发展成为研究环境微生物群落结构的重要分子生物学方法[3-4]。DGGE技术昀先是由Fischer和Lerman[5]于1979年提出的用于检测DNA突变的一种电泳技术。1993年Muzyer[6]等首次将DGGE技术应用于微生物生态学,并证实了这种技术在研究自然界微生物群落的遗传多样性和种群差异方面具有明显的优越性。1DGGE的原理DGGE的原理是根据DNA扩增产物的核苷酸序列不同进行片段的分离。由于同一温度下在同一浓度变性剂的聚丙烯酰胺凝胶中，序列不同的DNA片段有着不同的解链行为，从而影响其电泳迁移率，因此实现了不同的DNA片段在凝胶上分离形成位置不同的条带。在含有化学变性剂尿素(Urea)和去离子甲酰胺(Formamide)梯度的聚丙烯酰胺凝胶中电泳时，在各自相应的变性剂浓度下具有不同碱基序列的PCR产物在解链点(Meltingdomain)发生部分解链,造成各片段空间构象的改变，电泳速度会急剧下降，因此具有同样碱基序列的DNA集中在一处形成条带,而序列不同的DNA分子由于解链点不同，即在不同的位置形成条带，长度相同的DNA片段通过迁移率的差异分离成位置不同的带型，根据电泳条带的多寡和条带的位置可以辨别出样品中微生物的种类多少,分析活性污泥中微生物的多样性。2PCR-DGGE的操作过程2.1样品总DNA提取总DNA提取过程通常包括粗提取和纯化两个步骤。细胞裂解的方法主要包括机械法(如玻璃珠、超声波和冻融等)、化学法(如SDS、苯酚等)和酶法(如溶菌酶、蛋白酶K等)。通常情况下，一般采取1264辽宁化工2010年12月几种方法相结合的方式提取DNA，如机械法加酶法，或化学法加酶法等，具体的组合方式要根据样品的种类而变化。Krsek等[7]认为玻璃珠+溶菌酶+SDS组合可从土壤中获较高产量和纯度的DNA；李鹏[8]等研究发现，基于SDS的裂解法是用于活性污泥总DNA提取的可靠方法。2.2PCR扩增PCR扩增是PCR-DGGE技术的重要步骤，PCR产物的质量直接影响后续DGGE的条带。PCR扩增步骤如下:(l)双链DNA(模板)加热变性为单链；(2)引物与模板DNA单链结合（退火）；(3)引物延伸(扩增)。在分子生物学中,目前被广泛使用的16SrDNA通用引物是341f/534r(V3区)、341f/926r(V3-V5区)和968f/1401r(V6-V8区)。PCR扩增片段大小对DGGE分析影响也较大,200bp左右的片段(V3区)分离效果较好,但在系统发育分析中往往缺乏分类信息。450～500bp左右片段(V3-V5区或V6-V8区)的分类信息相对丰富,如果对于分类水平要求高的,应该选择968f/1401或341f/926r。常规的DGGE电泳技术对于长度超过500bp的DNA片段的序列变化情况,只能有50%的检出率[9]。应用“GC夹板”技术可使检出率提高到100%[9-10]。2.3凝胶和变性剂梯度的确定聚丙烯酰胺凝胶浓度通常根据DNA片段的大小来确定,当片段大小在200bp左右时,一般采用8%的凝胶,片段在500bp时用6%的凝胶。用梯度凝胶进行分离，可以在一定程度上提高分辨效果,对于200bp的片段,可以采用6%～12%的丙烯酰胺凝胶[11]。变性剂的梯度范围要根据垂直DGGE实验来确定,垂直实验曲线斜率较大的部分代表解链区域的Tm(解链温度)值,此时低温解链区的不同分子达到昀佳分离状态[12]。通常选择水平胶的的变性剂梯度范围为30%(相当于Tm范围10℃左右),对于16SrDNAV3区被广泛使用的变性剂梯度范围是30%～60%，对于不同的样品还需要进行调整。2.4染色方法的选择昀常用的几种染色方法是溴化乙啶（EthidiumBromide,EB）[13]，SYBRGreenI[13],SYBRGreenII，SYBRGold[14]和银染法[15]。EB法染色的灵敏度昀低，并且EB有毒。银染法灵敏度比EB高200倍,是目前昀灵敏的方法。它不但能染双链DNA，也能染单链DNA，但它的缺点是不能用于随后的杂交分析[13]。荧光核酸染料SYBRGreenI，SYBRGreenII和SYBRGold相比EB，能更好地消除染色背景，因此它们的检测灵敏度比EB法高很多，并可直接进行杂交分析。2.5DGGE图谱的测序及分析将DGGE凝胶上的优势条带切下，回收其中的DNA，并且克隆和测序,所得序列提交到GenBank，采用BLAST程序与已知序列进行相似性分析。GenBank将按照与测得序列的相似性高低列出已知序列名单、相似性程度以及这些序列相应的微生物种类，所得序列可以构建系统进化树，进行进一步的分析。3PCR-DGGE在厌氧反应器中的应用近年来，随着分子生物学的不断发展，PCR-DGGE技术逐渐在厌氧反应器中开始应用，例如，用于处理啤酒厂[16]、酿酒厂[17]和造纸厂[18]废水的UASB反应器内颗粒污泥微生物多样性分析。魏利[19]等研究了不同靶序列对厌氧折流板反应器微生物多样性分析的影响，研究表明,采用PBS洗涤污泥和超声振荡有利折流板于硫酸盐还原污泥总DNA提取;不同引物DGGE图谱分析,群落多样性存在显著的差异。刘然[20]等研究了厌氧折流板反应器中微生物种群演替特征，结果表明:ABR反应器颗粒污泥微生物中杆菌占优势,其中前端的微生物生长较好,活性高;沿反应器流程方向,各隔室微生物总量逐渐降低,真细菌相对丰度随之递减,此外,ABR反应器前端以真细菌为主,而后端隔室古细菌含量升高,微生物种群随流程发生显著演替,但5个隔室间真细菌的Shannon-Wiener多样性指数没有显著性变化。UPMGA聚类分析表明ABR反应器前端以发酵产酸作用为主,后端以产甲烷作用为主,ABR反应器具有明显的分阶段多相工艺特点。在PCR-DGGE的基础上，刘然等还结合FISH手段，定量分析了厌氧折流板反应器中的群落变化。左剑恶[21]等利用分子生物技术对厌氧颗粒污泥中微生物种群结构进行了研究，结果表明,随着反应器COD负荷的增加以及运行时间的延长,真细菌种群结构相对较稳定,而古细菌种群结构则发生了较明显变化,其中占优势的古细菌种类逐渐减少;将有代表性的7个古细菌条带切胶回收并测序,结果显示,反应器运行后期占优势的菌种主要包括甲烷微粒2010年12月陈玉霞，等：PCR-DGGE技术在厌氧反应器中的应用1265菌(Methanocorpusculum)、甲烷杆菌(Methanobact-erium)和甲烷髦毛菌(Methanosaeta)等。4DGGE的应用前景PCR-DGGE技术相对传统的分离培养方法有了很大改进，但是依然有缺陷。比如，受DNA片段长度的限制,对较长的片段分辨率有所下降,从而限制了用于系统发育分析的序列信息量；不同类型细菌种群的16SrDNA有着相同的迁移行为,一条条带可能代表几种菌,也可能不同的几条DGGE带代表同一种细菌[22]；不能确定代谢活性、细菌数量和基因表达的水平等，因此，PCR-DGGE必须与其他技术手段相结合才能弥补其不足，如酶学技术、荧光原位杂交（FISH）技术等，这样，PCR-DGGE将会是研究环境微生物强有力的技术手段。参考文献：[1]马溪平.厌氧微生物学与污水处理[M].北京:北京北学工业出版社，2005.[2]张自杰.排水工程(下册)[M].4版.北京:中国建筑工业出版社，2000．[3]Muyzer,G.,.DGGE/TGGEamethodforidentifyinggenesfromnaturalecosystems[J].Curr.Opin.Microbiol.1999,2:317–322．[4]Muyzer,G.,E.C.deWaal,andA.G.Uitterlinden.Profilingofcomplexmicrobialpopulationsbydenaturinggradientgelelectrophoresisanalysisofpolymerasechainreaction-amplifiedgenescodingfor16SRrna[J].ApplEnvironMicrobiol,1993,59:695-700.[5]MuyzerG,SmallaK.Applicationofdenaturinggradientgelelectrophoresis(DGGE)andtemperaturegradientgelelectrophoresis(TGGE)inmicrobialecology[J].AntonievanLeeuwenhoek,1998,73:127-141．[6]MuyzerG,WaalEC,UitterlindenAG.Profilingofcomplexmicrobialpopulationsbydenaturinggradientgelelectrophoresisanalysisofpolymerasechainreactionamplifiedgenesencodingfor16SRrna[J].ApplEnvironMicrobiol,1993,59:695-700．[7]KrsekM,WellingtonEMH.ComparisonofdifferentmethodsfortheisolationandpurificationoftotalcommunityDNAfromsoil[J].Microbiol