PCRDGGE研究青海农村户用沼气池微生物群落结构

中国环境科学2015,35(6)：1794~1804ChinaEnvironmentalSciencePCR-DGGE研究青海农村户用沼气池微生物群落结构韩睿1,2,3,陈来生2,3,李莉3,刘德立1*(1.华中师范大学生命科学学院,遗传调控与整合生物学湖北省重点实验室,湖北武汉430079；2.青海省高原作物种质资源创新与利用国家重点实验室培育基地,青海西宁810016；3.青海省农林科学院,青海省蔬菜遗传与生理重点实验室,青海西宁810016)摘要：采用变性梯度凝胶电泳(DGGE)分析技术,对青海农村户用沼气池内细菌及古菌群落结构进行分析.结果表明,沼气池含有丰富的细菌及古菌类群,且泥样间的细菌和古菌的群落结构存在差异.4个户用沼气池发酵系统中,细菌分属于5个门,优势类群为拟杆菌门(Bacteroidetes)、厚壁菌门(Firmicutes)和变形菌门(Proteobacteria).在属分类水平上,属于24个类群,最优势类群为理研菌科佩特里单胞菌属(Petrimonas)、假单胞菌属(Pseudomona)、泰氏菌属(Tissierella)和梭菌属(Clostridium).同时,沼气池发酵系统中古菌主要包括热丝菌属(Thermofilum)、甲烷短杆菌属(Methanobrevibacter)、甲烷囊菌属(Methanoculleus)、产甲烷菌属(Methanogenium),其中,Methanobrevibacter和Methanogenium是沼气池内最优势的产甲烷菌.说明沼气池的产甲烷途径主要是氢营养代谢类型,水解、酸化过程主要由来自动物消化系统内的细菌完成.关键词：PCR-DGGE；青海；户用沼气池；微生物群落结构中图分类号：X172文献标识码：A文章编号：1000-6923(2015)06-1794-11MicrobialcommunityofruralhouseholdbiogasdigestersinQinghaibyPCR-DGGE.HANRui1,2,3,CHENLai-sheng2,3,LILi3,LIUDe-li1*(1.HubeiKeyLaboratoryofGeneticRegulationandIntegrativeBiology,SchoolofLifeScience,CentralChinaNormalUniversity,Wuhan430079,China；2.StateKeyLaboratoryBreedingBase,KeyLaboratoryofQinghaiProvinceforPlateauCropGermplasmInnovationandUtilization,Xining810016,China；3.QinghaiKeyLaboratoryofVegetableGeneticsandPhysiology,QinghaiAcademyofAgricultureandForestryScience,Xining810016,China).ChinaEnvironmentalScience,2015,35(6)：1794~1804Abstract：ThemicrobialcommunitycompositioninruralhouseholdbiogasdigestersofQinghaiwasinvestigatedwithpolymerasechainreaction-denaturinggradientgelelectrophoresis(PCR-DGGE)technology.Theresultsshowedthatthediversityofbacteriaandarchaeawererich,andtheshiftofmicrobialcommunitywasobviousindigesters.Thebacterialcommunitiesinfourbiogasdigesterswereclassifiedintofivephyla,Bacteroidetes,FirmicutesandProteobacteriawereidentifiedtobedominant.Atgenomelevel,belongingtotwenty-fourcommunities,Petrimonas,Pseudomona,TissierellaandClostridiumweretheabundanttaxa.Meanwhile,thespeciesofarchaealcommunitywerecalssifiedasMethanobrevibacter,Methanogenium,MethanoculleusandThermofilum,andthefirsttwoclassesweredominantinthedigesters.Notably,themethaneproducedbyhydrogennutritionmethanogens,andthedominantfermentativebacteriaduringthehydrolysisandacidogenesisweredetectedfromanimaldigestivesystem.Keywords：PCR-DGGE；Qinghai；householdbiogasdigesters；microbialcommunitystructure沼气是一种极具应用前景的可再生清洁生物能源[1-2].发展沼气是解决我国农村能源危机、改善农村生态环境、实现农业可持续发展的有效途径[3].高效稳定的微生物生态系统是沼气产气率的保证,是沼气池稳定运行的关键.Zakrzewski等[4]对生物沼气池的样品进行研究,揭示了产甲烷菌群的代谢途径,认为在以后的生产中可以通过对微生物群落的监控优化生产;刘卫国等[5]对沼气生物脱硫系统中微生物群落构成进行分析,确定了系统中的优势菌种.研究并优化沼气发酵过程中的微生物群落结构,有利于充分发挥各种收稿日期：2014-11-20基金项目：青海省蔬菜遗传与生理重点实验室(2014-Z-Y15)*责任作者,教授,[e-mail]6期韩睿等：PCR-DGGE研究青海农村户用沼气池微生物群落结构1795群的生态功能,使沼气发酵在粪污治理中得到科学合理应用[6].青海省地处青藏高原东北部,平均海拔在4000m以上,具有气温低、昼夜温差大、太阳辐射强等特点.全省年平均气温在-4℃~8℃之间,冬季气温低(平均气温为-8℃~-18℃)且持续时间长.自2003年以来,青海省在农村沼气建设国债项目的支持下,在农村沼气建设和利用方面取得了一定成效.然而,由于青海省所处的地理位置及气候条件,导致其沼气技术开发落后,存在着诸多问题.进入冬季(当年11月~翌年4月),寒冷的气温导致户用沼气池内发酵微生物生理活性降低,产生的微量沼气不够应用,不能维持发酵系统自身的运转,甚至出现供气中断现象(用半年停半年).沼气池的闲置浪费,使农民建沼气池、用沼气的积极性降低,也在一定程度上影响了青海沼气的推广普及[9].据统计,到目前为止青海省绝大多数户用沼气池在冬季没有得到很好利用.由于农村户用沼气池发酵系统是一个复杂的微生物生态系统,微生物群落结构决定其生态功能.因此,深入解析青海沼气发酵生态系统的微生物群落结构特征,是指导青海沼气生产的关键.绝大多数沼气发酵微生物难以培养,无法采用传统纯培养方法来研究微生物群落结构和代谢关系[6-9].变性梯度凝胶电泳技术(DGGE)以DNA分子为研究对象,能有效分析复杂微生物群落结构及其多样性,无需培养微生物,操作简单快速,已被广泛用于各种环境中微生物生态的研究[10-12].迄今为止,对寒区农村户用沼气发酵微生物群落结构与功能的研究相对较少,而青海地区的此类研究还未见报道.本研究利用PCR-DGGE技术,以青海省乐都县蒲台乡李家台村的沼气池为研究对象,探明青海农村户用沼气池发酵微生物的群落结构特征,为进一步揭示微生物群落结构与功能的关系,改进青海省沼气发酵工艺、增加沼气池产气量、实现农村户用沼气发酵的稳定运行提供有价值的参考.1材料与方法1.1户用沼气池青海省乐都县蒲台乡李家台村(102°27′22″E,36°21′14″N,海拔2223.27m~2228.26m)有农户79户.经初步调查分析,共建有沼气池65座,33.8%能够正常运行,运行效率不高,但相对青海省而言,该村沼气池的运行情况是比较好的.所建沼气池构造统一,为圆形,容积为8m3,采用“一池三改”的模式,将沼气池与改厕所、改暖棚猪舍与改厨房相结合,通过庭院的合理设计,粪便直接入池.发酵液pH值为7.0~7.5、主要投入原料为人畜的粪便.1.2样品采集选取利用率相对较高,且能够在冬季供气不中断的4户沼气池底部取样.采样时间为2014年6月.样品采集后4℃封存,带回实验室后立即对样品进行处理.分别编号为LD1、LD2、LD3、LD4,其运行状况等基本情况见表1.1.3基因组DNA提取将污泥样品置于2mL离心管中,用土壤基因组快速抽提试剂盒(上海生工)提取基因组DNA,经1%的琼脂糖凝胶电泳检测后保存于4℃备用.1.4PCR扩增将污泥样品置于2mL离心管中,用土壤基因组快速抽提试剂盒(上海生工)提取基因组DNA,经1%的琼脂糖凝胶电泳检测后保存于4℃备用.1.4.1细菌PCR扩增所用引物为细菌16SrDNAV3高变区357F-GC(5'-CGCCCGCCGCG-CCCCGCGCCCGGCCCGCCGCCCCCGCCCCCCTACGGGAGGCAGCAG-3')和518R(5'-ATTA-CCGCGGCTGCTGG-3'),反应体系为50μL总体积,ddH2O41.25μL,10×Buffer(含2.0mmol/LMgCl2)5μL,dNTP(10mmol/L)1μL,357F-GC(10μmol/L)1μL,518R(10μmol/L)1μL,Taq酶(5U/μL)0.25μL,模板DNA0.5μL.反应程序:94℃预变性4min;30个循环(94℃30s;56℃1min;72℃30s);72℃延伸7min.1.4.2古菌PCR扩增巢式PCR扩增,利用两轮引物.第一轮引物为ARCH46F(5'-YTAAGC-CATGCRAGT-3')和ARCH1017R(5'-GGCCAT-GCACCWCCTCTC-3'),第二轮为PARCH344F(5'-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGACGGGGHGCAGCAGG1796中国环境科学35卷CGCGA-3')和UNIV522R(5'-GWATTACCGC-GGCKGCTG-3').反应体系为50μL总体积,ddH2O41.25μL,10×Buffer(含2.0mmol/LMgCl2)5μL,dNTP(10mmol/L)1μL,上下游引物(10μmol/L)各1μL,Taq酶(5U/μL)0.25μL,模板DNA0.5μL.反应程序:94℃预变性4min;30个循环(94℃30s;56℃1min;72℃30s);72℃延伸7min.细菌和古菌PCR产物均用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测.表1户用沼气池基本情况调查表Table1Basicinformationofhouseholdbiogasdigesters利用率样品编号主要投入原料沉积物颜色、状态酸碱度(pH值)夏季冬季LD1猪粪(50%)、人粪(40%)、驴粪(10%)黑色烂糊状7.2早餐、午餐、晚餐(有时晚餐不够)早餐LD2人粪(40%)、猪粪(60%)黑色稀糊状7.2早餐、午餐、晚餐早餐、午餐LD3猪粪(70%)、人粪(30%)灰黑色稀糊状7.5早餐、午餐、晚餐早餐、午餐(有时午餐不够)LD4猪粪(50%)、人粪(40%)、鸡粪(10%)灰黑色烂糊状7.4早餐、午餐、晚餐(有时晚餐不够)早餐1.5变性梯度凝胶电泳(DGGE)及数据分析采用D-Code突变检