TTC脱氢酶测定方法的探讨朱南文

中国沼气ChinaBioga、xg,6,14(2)TTC一脱氢酶测定方法的探讨朱南文闺航陈美慈赵宇华(浙江农业大学环保系,杭州310029)摘要:本文以硫化钠作还原荆,以甲苯为提取容剂,解决了氛化三苯基四氮哇(TTC)法浏定污泥脱氮酶活性中标准曲线制作繁琐和稳定性差的困难,并为该法的运用选择了良好的提取溶荆。本文也对浏定中的诸多影响因素进行了研究,确定了进行试验的最佳条件。关键词:脱氮晦,脱氢酶活性,污泥脱氢酶能酶促脱氢反应,即酶促有机物质脱氢的作用,它由活的生物体所产生。在废水生物处理中,由于它可以反映处理体系中活性微生物量及其对有机物的降解活性,因而成为一项考察污泥活性的重要指标仁,,2〕。测定脱氢酶的方法很多〔2一5〕,目前较为常用的是氯化三苯基四氮哇(TT)C法,该法主要选用无色的TTC作人为受体,受氢后生成红色的三苯基甲磨(TF)。在以往的文献中,此法一直存在着二个主要的缺点,即标准曲线制作繁琐和稳定性差,反映不了真实的TF生成量,以及提取溶剂的不理想。本文采用硫化钠代替连二亚硫酸钠作为TTC的还原剂,以甲苯为提取溶剂,克服了这些缺点,从而为TTC一脱氢酶活性测定方法的完善提供参考。1材料与方法1.1主要仪器和试剂.1.11主要仪器l()恒温培养箱(2)LXJ一R离心沉淀机(3)752紫外光栅分光光度计.1.12试剂l()TTC:分析纯(99.5%),上海试剂三厂一。(2)甲苯:分析纯t99.5%),杭州化学试剂厂。(3)三轻甲基氨基甲烷(Tirs)一HCI缓冲溶液,pH.76。(4)其它:硫化钠,连二亚硫酸钠,葡萄糖。1.艺样品制备取50山L印染废水活性污泥液(2.29/IJ)于250n飞I一锥形瓶中,用玻璃珠剧烈摇动将污泥打碎,离心后弃上清液,再用生理盐水补足,搅拌洗涤,反复三次。然后再用生理盐水稀释至原体积,用玻棒搅动,使污泥悬浮。备用。1.3实验方法1.3.1标准曲线的制作称取相当于50mg纯品量的已烘干的TTC于50mL容量瓶中,定容(1mgTTC/mL);分别向6只50mL容量瓶中依次注入1,2,3,4,5,6mLlmg/mL标准TTC溶液,用蒸馏水定容,是为工作液;取7支20mL容积带塞试管,依次加入lZnl一Tris一HCI缓冲液,lmL不同浓度的TTC工作液,lmL10写NaZS新配溶液,摇匀,放置Zomin(对照管不加TTC);反应完全后,各管分别中国沼气ChinaBiogas1996,14(2)加入smL甲苯,振摇,完全提取TF,稳定数分钟,取上层有机溶液在752紫外光栅分光光度计上492nm处比色(在比色皿中亦需稳定2分钟)。绘制标准曲线。1.3.2污泥脱氢酶活性测定取活性污泥制备液ZmL于带塞试管中,依次加入TirS一HCI缓冲液、。.lmol/L葡萄糖液、0.5%TTC各ZmL,置入37士1’C恒温箱中培养4h。取出,加2滴浓硫酸终止反应,准确加入smL甲苯,振摇,在4。。。rpm下离心smin,取有机溶剂层比色。在上述条件下,将hl产生1拼gTF的量为一个酶活力单位。2结果与讨论2.1标准曲线制作中TTC还原剂的选择以往文献中制作标准曲线时通常以连二亚硫酸钠为还原剂,将标准TTC还原为TF。但此法的缺点在于显色极不稳定。以在ZmLTriS一HCI缓冲液中加入lmL60拼g/mLTTC工作液的处理为例,当加入0.19连二亚硫酸钠后,溶液立即呈现红色,此时以甲苯提取红色TF在分光光度计492nm处比色,其光密度〔OD)值为0.470;但溶液色度随后逐渐减褪,在40min后几乎全部消失。这说明,TTC被还原成TF时,TF同时在消失,这可能是TF共扼双键被过剩的连二亚硫酸钠破坏的结果。而以10%硫化钠作还原剂的处理,显色完全后(20mm)色度稳定,即使在72h后亦不减弱,其OD值稳定在0.522左右(图1)。因此,以硫化钠代替连二亚硫酸钠作还原剂,效果较好。2.2提取溶剂的选择脱氢酶与TTC反应生成TF,TF颜色深说明脱氢酶活性高,因而TF是提取的关键所在。首先对文献中已报道的丙酮、甲醇、三氯甲烷三种提取剂及本实验新选用的甲苯进行了筛选,按照标准试验方法,反应完毕后,进行提取,离心,比色。结果表明(表1),在同等条件下,甲笨和三氯甲烷作为提取溶剂较好,但三氯甲烷比重比水大,提取离心后,其位置介于污泥与水层之间,操作起来不便。而甲苯则比重较小,上浮能力强,且有抑制脱氢酶活性的作用川,因此是一种较为理想的提取溶剂。表1不同提取溶剂的光密度(OD)值溶剂类型处理—甲苯三氯甲烷丙酮混浊甲醇OD佣20.3420.348不分层2.3波长选择对含一定量(60拼g)的TTC标准液按实验方法显色。在752紫外光栅分光光度计上进行吸收波长选择,结果表明,吸收峰在492nm处(图2)。硫化钠产aoù如雀架(N6廿自O)侧枷架连二亚硫酸钠2040时间(min)420460500540580波长(nm)图1不同还原剂对光密度(OD)值的影响图2三苯基甲晤(TF)的最大吸收峰中国沼气Chian方ozgas9916,14(2)52.4PH选择在pH分别为5,6,7,7.4,7.6,8,9,10条件一F进行反应,测其相对的酶活力。结果表明,活性污泥脱氢酶反应的pH值适宜范围为7~9,最适为7.6。2.5线性范围按本文标准曲线绘制所介绍的条件和方法操作,得结果如表2。设定y为OD492值,表2不同工作液浓度下的光密度值工作液浓度(肛g/m-l)光密度—20406080100OD4,20.1750.3530.5220.7020.856x为相应的工作液浓度,得到如下关系式:y=0·0084+0.00856xr=0.9997据此可以推出,在相当于n~80拌g/mLTTC工作液浓度范围内,光密度(O.D92)与产物浓度符合朗比定律。2.6培养时间根据酶活性的测定原则,培养时间应尽量短些,以避免因基质浓度下降,产物的形成以及酶本身的变性所带来的不良影响。但培养时间过短则酶促反应可生成的被检测物质的量太少,难以定量检测,因此应选择适宜的培养时间。在本实验设置的条件,每隔lh进行取样测定酶活,结果(图3)表明,在一定时间内污泥形成TF的量随时间延长而增加,但随着时间的延长,反应速率(OD/h)趋于平缓,培养时间以h5为佳。此时显色强度已便于检出,反应速率亦接近最大值。不过,各种活性污泥由于所组成的微生物种群及形成时间和其它条件的差异,反应的最佳时间也会发生改变川。石\自Oà瑙哥侧侧△光密度值城反应速率0.040.02N耳自Où侧娜架0246时间(h、图3士音养时间对污泥脱氢酶活性的影响3参考文献23456许晓路,申秀英.环境科学,1993;14(2):60俞毓馨等.环境工程微生物检验手册.北京:中国环境科学出版社.1990,163~165牛志卿等.微生物学通报,1994;21(1):59一61IehnardGeral.WaterPollutionRes,1965;2:105~109KlaPwijkAetal.WaterRes.1974;8(2):121许光辉,郑洪元.土壤微生物分析方法手册.北京:农业出版社,1986,252(本文收稿1995一12一05)TheStudyofDeterminationonTTC一DehydrogenaseAetivityZhuNanwen,MinHang,ChenMeiei,ZhaoYuhua(DePartmentofEnviro,:m。ntalScience,Zh刃;angAgricultuarlUniversil夕,Hangzhou310029)Abstraet:Current3,5,5一rr盈phenyltetrazoliuizi又T丁(’)一del飞ydrogenaseaeTlvltyde[ern飞Iningmerhodhastwodefeets.(、ne15rhatstandardeurveean’tbemadeeon丫eni七艺lrlyandsrably.Ar一oLI一er王5tllarorganiesoventusedroformazon(TF)15noreffieie月r.Thispaperrrso}vedth咬、seproblemsb丫ustrlgsodiumsulfideasrcdueerandtolueneorganieextraetanr,Thebesteond一t一onwasaI5oprescntcdbyeffeer人ngfaerorexperimentsonthedevelopednlethodeXtraCtasTFKeywords:dehydrogenasedehyd厂ogelrdseaetLvttyaetivesludge