氨氮胁迫下罗非鱼GIFTOreochromisniloticus机体免疫力的变化及其对海豚链球菌易感

生态环境学报2011,20(4):[e-mail]基金项目：现代农业产业技术体系建设专项资金（CARS-49）作者简介：陈家长(1964年生)，男，研究员，硕士，主要从事环境方面的研究工作。E-mail:[e-mail]收稿日期：2011-03-09氨氮胁迫下罗非鱼（GIFTOreochromisniloticus）机体免疫力的变化及其对海豚链球菌易感性的影响陈家长1,2，臧学磊2，胡庚东1，瞿建宏，范立民1，宋超11.中国水产科学研究院淡水渔业研究中心//中国水产科学研究院内陆渔业生态环境和资源重点开放实验室，江苏无锡214081；2.南京农业大学无锡渔业学院，江苏无锡214081摘要：研究了不同作用时间（0、24、48、96和120h）下不同质量浓度氨氮（对照组、1、3、5和10mg·L-1）对罗非鱼（GIFTOreochromisniloticus）血清SOD、AKP、溶菌酶和补体C3活性的影响，以及不同质量浓度氨氮（对照组、1、3、5和10mg·L-1）胁迫下罗非鱼对海豚链球菌的易感性。结果显示：在1.0mg·L-1氨氮质量浓度下，罗非鱼血清SOD活性在24h受到诱导；在3.0、5.0和10.0mg·L-1氨氮质量浓度下，罗非鱼血清SOD活性均受到抑制，最大抑制率分别达18.85%、23.47%和38.46%。在1.0mg·L-1氨氮质量浓度下，罗非鱼血清AKP活性在0~96h呈先降低后恢复的趋势；5.0和10.0mg·L-1实验组的血清AKP活性在24~120h则一直受到抑制。1.0mg·L-1实验组的罗非鱼血清溶菌酶活性在24~120h一直无显著变化，3.0、5.0和10.0mg·L-1实验组的血清溶菌酶活性随着氨氮质量浓度的升高而降低。1.0mg·L-1实验组的罗非鱼血清补体C3活性在各个采样时间下均大于对照组，而5.0和10.0mg·L-1实验组补体C3活性始终受到抑制。罗非鱼对海豚链球菌的易感性实验研究显示，置于3.0、5.0和10.0mg·L-1的罗非鱼的累积死亡率分别为43.33%、46.67%和63.33%，显著高于对照组和1.0mg·L-1实验组，表明氨氮质量浓度超过3.0mg·L-1能够增加罗非鱼对海豚链球菌的易感性。本实验认为，超过3mg·L-1的氨氮质量浓度胁迫能够显著降低罗非鱼的免疫力，增加对海豚链球菌的易感性。因此在罗非鱼健康养殖中，调控并降低氨氮质量浓度非常重要。关键词：罗非鱼；海豚链球菌；氨氮；免疫；死亡率中图分类号：X171.5文献标志码：A文章编号：1674-5906（2011）04-0629-06我国是世界上最大的罗非鱼养殖国家，在我国南方各省，罗非鱼的养殖产量已占到世界总产量的50%以上[1]。但是近年来，海豚链球菌（Streptococcusiniae）病的暴发给罗非鱼产业造成了严重的损失。该病的发生除了与病原菌本身的致病力有关，与养殖水体环境的恶化亦有很大关系[2]。一直以来，氨氮是水环境评估的重要标志之一。以氨氮质量浓度升高为标志的养殖水质恶化直接对水生动物的免疫力有极大的影响，更间接地增强了水生动物对病原菌的易感性[3-4]。由于鱼类处于生物进化的低级阶段，其免疫功能并不像高等脊椎动物那样由特异性免疫作用占主导地位，非特异性免疫系统在鱼体抵抗病原生物入侵时发挥着更为重要的作用。溶菌酶(lysozyme，LSZ)、超氧化物歧化酶(superoxidedismutase，SOD)、补体C3和碱性磷酸酶(alkalinephosphates，AKP)是重要的免疫相关因子，在非特异免疫作用的应答过程中发挥着不同的作用[5-9]。本文研究了氨氮的变化对罗非鱼免疫相关因子的影响，试图揭示在亚氨氮胁迫下，罗非鱼机体免疫力与其海豚链球菌易感性之间的关系，为研究罗非鱼海豚链球菌病暴发的环境机制提供相关资料，也为通过调控养殖环境来预防和控制疾病的发生奠定基础。1材料与方法1.1实验用鱼实验用鱼为罗非鱼(GIFTOreochromisniloticus)，于2010年5月取自中国水产科学院淡水渔业研究中心宜兴养殖基地，挑选正常、健康活泼的个体，平均体质量为(110.3±5.6)g（n=20），实验之前在温度为25℃的蓄养池中暂养7d。1.2实验用水实验用水为曝气3d以上的自来水。氨氮质量浓度0.1mg·L-1，溶解氧质量浓度6.0~6.5mg·L-1，pH为6.5~7.0，水质符合渔业水质标准。试验温度保持在25℃左右。1.3实验用菌实验用海豚链球菌(Streptococcusiniae)由广西水产研究所从发病鱼体中分离得到。菌株培养基为液体牛脑浸心培养基(BHIA)。具体含量比例为：牛脑浸粉0.5%、牛心浸粉为1%、胰蛋白胨为1%、葡萄糖为0.2%、NaCl为0.5%、pH为6.8~7.2。实630生态环境学报第20卷第4期（2011年4月）验用菌接种于100mL液体培养基，在28℃下培养24h，菌体含量达到6×108CFU·mL-1。1.4氨氮对罗非鱼感染海豚链球菌的影响实验分为2组，均设置对照组和实验组，对照组不添加任何物质，水体经测定，氨氮质量浓度为0.1mg·L-1，符合渔业水质标准。实验组设置4个梯度，氨氮质量浓度分别为1.0、3.0、5.0和10.0mg·L-1。每个梯度随机取健康罗非鱼10尾，分别在容量为80L的玻璃水族箱进行试验。第一组经腹腔注射0.1mL的海豚链球菌悬液（质量浓度6×108CFU·mL-1），分别置于不同质量浓度氨氮（1.0、3.0、5.0和10.0mg·L-1）的水族箱内，另一组经腹腔注射相同体积的BHIA培养基，也与试验组进行一样的处理。试验期间每天换水1/3，并用奈氏试剂法测定氨氮的质量浓度，并及时调节水中氨氮质量浓度。每个梯度设3个平行，共300条鱼（10×5×3×2）用作实验。每天观察罗非鱼的死亡情况，发现死鱼及时清理，试验持续14d。1.5氨氮对罗非鱼免疫参数的影响实验设置1个对照组和4个实验组。对照组不添加任何物质，经测定氨氮质量浓度约为0.1mg·L-1。实验组设置4个梯度，氨氮质量浓度分别为1.0、3.0、5.0和10.0mg·L-1。每个梯度随机取健康罗非鱼15尾，分别在容量为80L的玻璃水族缸进行试验，实验均设3个平行。每日换水1次，换水后实验组用NH4Cl（1000mg·L-1）调节氨氮水平，使其终质量浓度维持实验质量浓度水平。实验期间无自然死鱼现象，取样时间分别为0、24、48、96和120h，共225条鱼（15×5×3）用作实验。1.6样品采集与测定分别于胁迫后0、24、48、96和120h，对照组和实验组随机取2条鱼，连同3个平行实验的鱼，每个梯度共6条鱼。用一次性注射器（体积为5mL）从罗非鱼尾静脉取血，取出的血（0.8~1.2mL）置于1.5mLEppendorf离心管内，置于4℃冰箱内过夜，将血样于4000r·min-1离心20min，取上层血清进行SOD、AKP、溶菌酶和补体C3的测定。采用南京建成生物工程研究所提供的试剂盒测定鱼体的SOD、AKP、溶菌酶活性，测定方法为比色法。SOD单位为U·mL-1，AKP单位为金氏单位·100mL-1，溶菌酶的单位为mg·L-1。采用美国R&D公司提供的酶联免疫试剂盒检测补体C3的活性，单位为mg·L-1。1.7统计分析实验结果采用SAS软件进行差异显著性检验，显著性水平取α=0.05。2结果与分析2.1氨氮对罗非鱼感染海豚链球菌的影响所有注射培养基的实验组，罗非鱼没有出现死亡现象。从图1可以看出，3.0、5.0和10.0mg·L-1实验组在注射海豚链球菌24h就出现死亡，而对照组(0.1mg·L-1)和1.0mg·L-1实验组在注射后第3天和第2天才出现死亡，实验观察14d后发现，对照组、1.0、3.0、5.0和10.0mg·L-1实验组罗非鱼累积死亡率分别达到20.00%、26.67%、43.33%、46.67%和63.33%。10.0mg·L-1实验组死亡率最高，对照组死亡率最低，且随着氨氮质量浓度的升高，死亡率与质量浓度呈正相关关系。实验中死亡的罗非鱼均出现感染海豚链球菌的临床症状：眼球突出、体色发黑、腹鳍基部出血、胆囊肿大、肠道糜烂等。2.2氨氮对罗非鱼血清生理指标的影响2.2.1氨氮对罗非鱼血清SOD活性的影响从图2可以看出，1.0mg·L-1的实验组罗非鱼血清的SOD活性在24h时较对照组稍有提高，而其他各实验组均低于对照组，且在随着氨氮质量浓度的增加，SOD活性受到抑制。统计分析表明，1.0mg·L-1条件下，罗非鱼血清中的SOD活性在48h较对照组显著降低16.11%(P0.05)，在其他时间差异不显著；3.0mg·L-1条件下，罗非鱼血清的SOD活性在48h处较对照组显著下降了18.85%；5.0mg·L-1条件下，罗非鱼血清中的SOD活性在24、48、96和120h与对照相比均显著下降(P0.05)，分别下降20.66%、22.5%、21.88%和23.47%；10.0mg·L-1条件下，罗非鱼血清的SOD活性在48和960102030405060708002468101214t/d死亡率/%0.1mg/L1mg/L3mg/L5mg/L10mg/L图1不同的氨氮质量浓度下海豚链球菌对罗非鱼累积死亡率随时间的变化Fig.1Eachfishwasinjectedintraperitoneallywith0.1mLofS.iniaesuspension,andthenheldatdifferentammonia-N(control,1.0,3.0,5.0and10.0mg·L-1).Time-dependentalterationofcumulativemortality陈家长等：氨氮胁迫下罗非鱼（GIFTOreochromisniloticus）机体免疫力的变化及其对海豚链球菌易感性的影响631h处较对照组显著下降(P0.05)，分别下降了25.46%和38.46%，罗非鱼血清SOD活性在96h达到最低且与其他实验组相比差异显著(P0.05)。2.2.2氨氮对罗非鱼血清AKP活性的影响从图3可以看出，各实验组罗非鱼血清AKP活性均低于对照组，1.0mg·L-1实验组罗非鱼血清AKP活性在0~96h有先抑制后恢复的趋势，而对于高质量浓度组(5.0和10.0mg·L-1)罗非鱼血清AKP活性在各个采样时间一直受到抑制，保持较低的活性。统计分析表明，1.0mg·L-1条件下，罗非鱼血清AKP活性在24和48h较对照组相比显著下降（P0.05），分别下降了22.13%和35.01%；3.0mg·L-1条件下，罗非鱼血清AKP活性在24、48、96和120h处均显著下降，分别下降了34.74%、20.14%、20.47%和30.00%；对于高质量浓度组(5.0和10.0mg·L-1)，其罗非鱼血清AKP活性在各个采样时间较对照组相比均差异显著(P0.05)，分别下降了40.67%、42.42%、33.89%和31.03%及34.50%、40.26%、35.91%和34.48%。2.2.3氨氮对罗非鱼血清溶菌酶活性的影响从图4可以看出，3.0、5.0和10.0mg·L-1实验组罗非鱼血清的溶菌酶活性在各个采样时间均低于对照组，溶菌酶活性有随着氨氮质量浓度增高而降低的趋势。统计分析表明，对照组罗非鱼血清溶菌酶活性在各个采样时间与对照组相比无显著差异；1.0mg·L-1条件下，罗非鱼血清中溶菌酶活性同样在各个采样时间无显著差异，没有受到诱导或抑制作用；3.0和5.0mg·L-1条件下，罗非鱼血清溶菌酶活性在24h、96h和120h与对照组相比差异显著(P0.05)，分别下降了6.5%、24.06%和15.97%及26.93%、23.05%和21.13%；10.0mg·L-1条件下，罗非鱼血