白腐真菌生物技术与应用

白腐真菌生物技术与应用环境工程专业选修课主讲教师胡长庆课程安排与考核方式学时数32学时（包括讨论课时）白腐真菌生物学基础（理论基础）白腐真菌生物技术（应用基础）白腐真菌在环境保护中的作用（应用实践）考核方式闭卷考核成绩分配平时占40%；考核占60%课程内容简介1白腐真菌生物学基础白腐真菌研究的历史、现状与未来白腐真菌生物学（概念、分类、特点、生物降解等）2白腐真菌生物技术包括白腐真菌的培养、分离、酶技术、固定化技术等3白腐真菌在环境保护中的作用白腐真菌与水污染控制白腐真菌与土壤污染控制白腐真菌与重金属污染白腐真菌与大气污染控制白腐真菌与有机固体废物资源化1白腐真菌生物学基础白腐真菌研究的历史、现状与未来白腐真菌研究探索的历史20世纪70年代至20世纪90年代白腐真菌研究繁荣的现状以分子生物学为特征的理论研究白腐真菌研究发展的未来以工业化应用为终极目标白腐真菌生物学1、白腐真菌（WhiteRotFungi）的概念白腐真菌的概念不是生物学术语，而是一种功能描述的概念纤维素木腐真菌WoodRottingFungi木质纤维素Ligno-cellulose软腐真菌SoftrotFungi褐腐真菌BrownrotFungi白腐真菌WhiterotFungi木质素半纤维素多糖类软腐真菌：主要降解纤维素，对木质素降解缓慢且不彻底。褐腐真菌：主要降解纤维素、半纤维素和部分多糖类，几乎不降解木质素。白腐真菌：主要降解木质素和多糖类，对纤维素和半纤维素降解能力弱。小结到底什么是白腐真菌？白腐真菌的概念是从功能角度对其进行描述和界定的白腐真菌是一类能够引起木质白色腐烂的丝状真菌主要降解木质素和多糖类，对纤维素和半纤维素降解能力弱白腐真菌嗜热性好氧微生物2、白腐真菌的分类地位与主要种类2-1白腐真菌的分类地位生物界古菌“生物三界学说”示意图根据16SrRNA碱基序列特点，整个生物界被划分为细菌（bacteria）、古菌（archaea）和真核生物（eukaryotes）3大超界（Domain）白腐真菌属于真核生物超界。木腐真菌已知的有1600～1700种，大多数是担子菌和子囊菌。软腐真菌：子囊菌、半知菌褐腐真菌：大部分属于担子菌白腐真菌：主要是担子菌，少数为子囊菌2-2白腐真菌的主要种类已知白腐真菌种类有400多种，研究最为透彻，被称为白腐真菌研究模式菌种的是黄孢原毛平革菌（PhanerochaetechrysosporiumBurdsal）。黄孢原毛平革菌的生物学分类地位担子菌门Basidiomycota伏革菌科Corticiaceae非褶菌目Aphyllophorales层菌纲Hymenomycetes原毛平革菌属Phanerochaete门纲目科属黄孢原毛平革菌主要分布在北半球，其无性世代也被称为多粉侧孢霉（SporotrichumpulverulentumNovobranova）。白腐真菌主要分布于8个菌属革盖菌属Coriolus原毛平革菌属Phanerochaete卧孔菌属Poria层孔菌属Fomes多孔菌属Polyporus烟管菌属Bjerkandera侧耳属Pleurotus栓菌属Trametes研究较多，且表现出较强降解能力的菌种有20种污色原毛平革菌丝核菌糙皮侧耳、平菇红孔菌变色栓菌、云芝韧革菌漏斗状侧耳、凤尾菇多孔菌毛栓菌短射脉菌裂褶菌、树花金孢霉菌烟管菌短孢射脉菌维氏针层孔菌拟蜡菌香菇、椎茸毛革盖菌木蹄层孔菌射脉菌3、白腐真菌的生理特点白腐真菌是一个庞大的生物家族，各成员的生理特点会表现出很大的差异。笼统的谈白腐真菌的生理生化特征和性质，既不现实，也不准确。黄孢原毛平革菌黄孢原毛平革菌具有发达的菌丝体，菌丝常为多核，少有隔膜，无锁状联合。多核分生孢子常为异核，担孢子却是同核体。交配系统有同宗交配和异宗交配。黄孢原毛平革菌的生长具有营养生长期和子实体生长期。锁状联合：担子菌的次生菌丝每一个细胞都有二个核，其中一个核来自母本，一个来自父本，当双核细胞进行细胞分裂时，在二个核之间外生一个短小弯曲的分枝，核移动，在二核之间生出一个突起如钩状，一个核进入钩，一个留在菌丝。钩中保留一个核，一个往后移，菌丝中二个核一往前一个往后移钩状突起向下弯曲与细胞壁接触溶化，分枝基部生分隔膜（分隔中间有孔道），在原分支外形成一隔膜，产生一个新细胞双核体，在分隔处保留一个桥形结构。分生孢子无性繁殖，通过菌丝体的裂殖产生。担孢子有性繁殖，必须通过菌丝体细胞的锁状联合过程。同宗交配和异宗交配两条可互相交配的单核菌丝融合担孢子一次菌丝担孢子一次菌丝单核萌发二次菌丝双核二次菌丝担孢子······只要同一孢子萌发的单核菌丝间的互相结合生出双核菌丝后，就可形成子实体，这种现象称为同宗交配。反之，只有异性的单核菌丝（不同孢子），才能结合成双核菌丝，这种结合方式称为异宗交配。3-1白腐真菌的生长与代谢特点（黄孢原毛平革菌）营养期初生生长白腐真菌繁殖期次生生长停滞期对数期细菌静止期生长是线性的，生物量显著增加。生长基本停滞，甚至发生生物量的下降。诱因：氮限制（nitrogenlimitation,N-L）碳限制（carbonlimitation,C-L）N-L在木质素降解中的作用:实质上是白腐真菌在进化过程中对环境中氮缺乏的一种生理适应。C-L在木质素降解中的作用:主要是它和菌丝体质量的减少像偶联，从而启动了次生代谢。与木质素降解有关的几个基本概念营养限制N-L和C-L木质素的降解木质素降解酶的合成要求木质素降解条件Ligninolyticcondition培养体系生理特征参与的酶木质素降解培养Ligninolyticculture木质素降解活性（木质素降解活动）Ligninolyticactivity木质素降解酶Ligninolyticenzyme白腐真菌对木质素的降解过程是一个共代谢(cometabolized)过程木质素完成降解过程白腐真菌？+生长底物Growthsubstrate白腐真菌共代谢的两种方式1、某种生物将一种底物转化，却无法在这种底物上生长，即生物体不能利用这种底物氧化所产生的能量去维持生长。2、一些生物为了共同的效应，共用其生物化学资源，协同作用，对化合物进行降解。白腐真菌降解木质素属于何种方式？小结3-1白腐真菌的生长与代谢特点白腐真菌的生长具有营养生长期和子实体生长期。锁状联合分生孢子担孢子同宗交配异宗交配营养期白腐真菌生长是线性的，生物量显著增加；繁殖期（子实体体生长期）生长基本停滞，甚至发生生物量的下降。氮限制（N-L）碳限制（C-L）白腐真菌对木质素的降解过程是一个共代谢过程共代谢的两种方式3-2白腐真菌在培养中的特点（黄孢原毛平革菌）这里的培养特指实验室中小规模的,以研究基本规律为目的的培养接种物接种方式菌丝体孢子按干重或是湿重计量优点：能准确量化能保证碳、氮营养限制应用范围：基础研究和应用研究初期接种方式：制备孢子悬浮液（sporesuspension,SS）按培养基量成一定比例接入关键是接种物的定量培养方式(实验室规模的一般性培养)按培养基的物理状态划分半固体培养体系固体培养体系液体培养体系静置培养Standingculture振荡培养Shakingculture静置培养Standingculture固定台面孢子1-2天菌丝垫或菌垫Mycelialmat条件适宜10天左右……白色粉状物—孢子1、尽量采取浅层培养方式；2、尽量避免菌墊起褶，尤其在培养初期菌墊很薄的时候；3、氧气的扩散速度是静置培养时决定白腐真菌降解木质素能力的限制性因子；振荡培养Shakingculture振荡培养仪器孢子1-3天菌丝团或菌团Mycelialpellets1、菌团的大小及数量随接种量和转速而变化：接种量大，菌团大；转速越大，菌团越小，数目越多；（100mL三角烧瓶→40mL培养液）2、一般而言，在100～200r/min条件下，菌团直径在3～5mm；3、主要为细菌系统建立的振荡培养技术，实际上并不适合直接应用于白腐真菌系统，主要是由于白腐真菌对振荡所产生的机械剪切力高度敏感；固体培养体系白腐真菌的固体培养主要是平板培养，少量进行斜面培养。平板培养的目的：①扩大菌的生物量或是大量获得孢子；②鉴定菌的酶活性或扫描菌对化学物质的降解能力；③用于菌种的分离筛选、诱变、驯化或是短期的保藏；斜面培养的目的：菌种的中、长期保藏；孢子或菌丝体平板培养斜面培养数日数日气相生长气相生长菌丝层菌丝层气生孢子气生孢子3-3环境因子对白腐真菌代谢活动的影响（黄孢原毛平革菌）白腐真菌生理活动木质素降解酶的合成木质素降解酶的活性环境因子培养参数的操作、调控和优化菌的代谢或降解潜能开发利用的关键建立一个合理的反应体系涉及的环境因子或培养条件包括：①培养基成分；②活性添加成分；③氧；④pH；⑤温度培养基成分实验培养最佳碳源为葡萄糖碳源物质香草酸钠:支持菌的生长,也可支持木质素降解;葡萄糖酸钠:支持菌的生长,但是木质素矿化程度低于甘油和琥珀酸钠;葡萄糖酸内酯:支持菌的生长,但是木质素矿化程度低于甘油和琥珀酸钠;甘油:可当碳源也可能源,支持木质素降解,是筛选菌突变体的碳源;琥珀酸钠:可当碳源也可能源,支持木质素降解;葡萄糖:支持菌的生长,支持木质素矿化程度高;纤维素:支持菌的生长,支持木质素矿化程度极高;优劣氮源物质营养氮源的种类对木质素降解的影响不大，重要的是氮源的浓度；氮丰富状态对木质素代谢会产生负面影响；铵类氮源会抑制一些酶的合成，产生“氨代谢物抑制”现象；维生素缓冲成分金属成分硫胺素是白腐真菌生长和木质素代谢的必须成分；乙酸钠、琥珀酸钠、酒石酸钠是三种最为常用的缓冲成分；主要功能，或作为一般的营养元素，或作为酶的结构组成和活性因子；活性添加成分活性添加成分（activatedadditive）有利于提高或保护木质素降解系统，可以提高培养体系的反应性。VA（藜芦醇，3,4-二甲氧基苯甲醇）白腐真菌本身在生长过程中可以产生VA（次生代谢物），外源加入一定量的VA可以显著提高木质素过氧化物酶的合成及活性。芳族化合物起到氧化还原调节剂的作用，常见的有3,4-二甲氧基苯甲醇和3-羟基邻氨基苯甲酸盐。有机酸表面活性剂有机酸，如甘醇酸（glycolate）、乙醛酸（glyoxylate）、草酸（oxalate）等，可以促进木质素降解活动。其中，草酸的作用尤其引起重视，草酸具有刺激锰过氧化物酶及调节细胞外酸碱度的功能。白腐真菌液体培养体系中加入表面活性剂可以有效地保护木质素降解酶免受因机械剪切力所造成的结构破坏或活性丧失。最为常用的表面活性剂Tween80（吐温80）氧环境中氧的浓度对白腐真菌的生理代谢及木质素降解活动有很大影响。但是，绝对不能简单的认为是氧的绝对浓度问题，起关键作用的是白腐真菌真正所能获得的有效氧的多寡。pH白腐真菌生长所需的适宜pH为5.5左右，稍高于木质素降解所要求的最佳pH4.5。当培养体系pH低于3.5或是高于4.5的情况下，会显著抑制木质素的降解和降解酶系统的工作。温度白腐真菌生长扩增所需的温度范围在25～39℃，要求并不十分严格。4、白腐真菌酶学简介4-1白腐真菌主要酶种概述H2O2产生酶系葡萄糖氧化酶乙二醛氧化酶甲醇氧化酶VA氧化酶其他酶其他酶系过氧化物歧化酶葡糖苷酶苯丙氨酸解氨酶还原脱卤酶系统醌还原酶芳烃硝基还原酶蛋白酶木质素氧化酶系需H2O2的过氧化酶漆酶Lac木质素过氧化物酶LiP锰过氧化物酶MnP白腐真菌木质素降解酶系统（ligninolyticenzymesystem）H2O2产生酶系共同作用：以小分子有机物为底物，将分子氧化还原为H2O2。葡萄糖氧化酶细胞内合成分泌到细胞外环境，将糖类物质氧化还原为H2O2。乙二醛氧化酶为细胞外的含铜氧化酶，主要以醛类物质为底物。而醛类物质恰好是葡萄糖氧化的中间产物。其他酶参与H2O2的产生。主要有甲醇氧化酶，VA氧化酶等。漆酶（Lac）木质素过氧化物酶（LiP）能氧化高氧化还原电位的化合物，催化酚类、非酚类物质氧化，参与木质素解聚。锰过氧化物酶（MnP）表现出对锰二价离子的绝对需要，氧化氧化还原电位相对低的