鲍曼不动杆菌生物膜形成机制研究进展马晓春

中国感染与化疗杂志2018年1月20日第18卷第1期 Chin J Infect Chemother, January. 2018, Vol. 18, No. 1124·综述· 基金项目：贵州省教育厅青年科技人才成长项目（黔教合KY字【2016】208）；遵义市科技局遵义医学院科学技术联合资金项目（遵市科合社字【2016】41号）；遵义医学院硕士科研启动基金（F-833）。作者单位：遵义医学院实验动物中心，贵州遵义563000；*基础医学院。作者简介：马晓春（1987—），男，硕士，实验师，主要从事细菌生物膜研究。通信作者：高丽丽，E-mail：[e-mail]。鲍曼不动杆菌生物膜形成机制研究进展马晓春1， 代 军1， 徐 磊1， 张仕斌1， 高丽丽*关键词：鲍曼不动杆菌；生物膜；调控机制中图分类号：R378文献标识码：A文章编号：1009-7708 ( 2018 ) 01-0124-05DOI: 10.16718/j.1009-7708.2018.01.024ResearchadvancesonthemechanismofbiofilmformationinAcinetobacterbaumanniiMAXiaochun,DAIJun,XULei,ZHANGShibin,GAOLili.（LaboratoryAnimalCenter,ZunyiMedicalUniversity,ZunyiGuizhou563000,China）鲍曼不动杆菌（Acinetobacterbaumannii）是一种革兰阴性杆菌，广泛存在于自然界，是目前医院感染最重要的条件致病菌之一。该菌常见于重症患者及免疫力低下人群，可引起医院获得性肺炎以及血流、腹腔、中枢神经系统、泌尿系统和皮肤软组织等感染，病死率高[1-2]。随着临床用药的增加，鲍曼不动杆菌耐药性有逐渐升高的趋势，给临床治疗带来了极大困难[3]。研究证实，临床分离的鲍曼不动杆菌菌株几乎都具有较强的细菌生物膜形成能力，生物膜一旦形成，细菌就具有极强的耐药性和致病性[4-5]。Rumbo-Feal等[6]利用RNA-seq技术对生物膜状态下和浮游状态下的鲍曼不动杆菌mRNA表达差异进行分析发现，生物膜状态下1621条基因表达上调，且有55条基因只在固着状态下表达。这些差异主要涉及氨基酸和脂肪酸代谢、运动性、主动运输、DNA甲基化、铁获取、转录调控和群体感应系统（QS）。本文就鲍曼不动杆菌生物膜形成过程以及调控机制的最新研究进展做简要综述，以期为鲍曼不动杆菌生物膜的防控提供参考。1生物膜的结构和功能细菌生物膜是指细菌在生长过程中黏附于生物或非生物表面后，被细菌自身产生的胞外多聚物基质包裹而形成的细菌群体。当细菌以生物膜形式存在时，耐药性明显增强（10～1000倍），抗生素并不能有效清除细菌生物膜，还可诱导耐药性产生[7]，这是临床上难治性感染的重要原因之一。生物膜不仅利于细菌适应不同环境，有效抵制机体的防御能力，更可以抑制抗生素对细菌的杀灭作用。2鲍曼不动杆菌生物膜形成的调节机制细菌生物膜的形成是一个复杂有序的动态过程，生长周期一般分为5个阶段，即最初定植阶段、不可逆黏附阶段、生物膜早期形成阶段、发展成熟阶段和解聚再定植阶段。研究发现，鲍曼不动杆菌在48h内就能够形成成熟的生物膜[8]。目前发现的影响鲍曼不动杆菌生物膜形成的因素主要有：菌毛合成系统，BfmRS双组分调控系统、细菌QS、生物膜相关蛋白（Bap）及外膜蛋白等中国感染与化疗杂志2018年1月20日第18卷第1期 Chin J Infect Chemother, January. 2018, Vol. 18, No. 1125几个方面。除此之外，blaPER-1、O-糖基化系统、核糖核酸酶T2家族蛋白、pgaABCD、金属离子浓度、蓝光、乙醇和环境温度等多种因素都可影响生物膜的形成。2.1菌毛合成系统黏附是生物膜形成至关重要的初始阶段。研究证实，鲍曼不动杆菌19606型菌株的菌毛在非生物表面黏附、微菌落形成及生物膜形成初始阶段具有重要作用[9]。有6个基因（csuAB/A/B/C/D/E）参与调节菌毛合成，组成了CsuA/BABCDE菌毛合成调控系统。其中csuAB、csuA、csuB3个基因编码的菌毛的亚单位结构；csuC编码伴侣蛋白（chaperone），参与菌毛蛋白的转运；csuD编码引导分子（usher），是一个具有孔道的蛋白，可以结合黏附素（adhesin）；csuE编码黏附素分子。基因csuE是CsuA/BABCDE的重要部分，参与细菌菌毛形成、黏附和生物膜形成。菌毛的组装分泌过程依赖csuC表达的分子伴侣引导合成系统（chaperone-usher pili assembly system），其中伴侣蛋白的功能是结合和稳定菌毛亚单位，防止亚单位的水解，引导分子则可以在细菌外膜形成孔道，与伴侣蛋白协同组装和分泌菌毛。通过扫描电镜（scanning electron microscope，SEM）观察发现，鲍曼不动杆菌19606型菌株细胞存在长、短两种菌毛，在非生物表面黏附时两种菌毛需同时存在[10]。但csuE突变株仅表达短菌毛，而黏附到上皮细胞的能力却比19606型野生株强，表明对真核细胞的黏附不依赖于CsuA/BABCDE产生的菌毛[11]。最新研究发现，LH92_11085是鲍曼不动杆菌MAR002株操纵子基因的一部分，SEM和生物膜测定实验表明该基因受抑制后导致细菌黏附到A549细胞以及在塑料表面生物膜形成能力明显减弱[12]。透射电镜（transmission electron microscope，TEM）分析后发现在LH92_11085突变株上缺乏长菌毛的形成。同时，LH92_11085也与细菌毒力相关。由此可见，鲍曼不动杆菌黏附到人体上皮细胞和非生物表面的机制并不完全相同，且受多种因素影响。长、短两种菌毛在细菌黏附到生物表面和非生物表面过程中发挥的作用仍需进一步研究。2.2 BfmRS双组分调控系统研究发现[13]，BfmRS双组分调控系统（two-component regulatory systems）可以调控CsuA/BABCDE菌毛合成系统。该系统由感受器激酶BfmS和反应调控因子BfmR组成，分别由bfmS及bfmR编码合成。bfmR位于bfmS的下游，当BfmS受信号刺激激活后，磷酸化的BfmR对csuA/BABCDE基因簇的表达进行调控，从而影响菌毛的合成分泌、细菌的黏附和生物膜的形成。当BfmS正常，而BfmR活性受抑制后，csu基因不表达，从而无法产生菌毛，最终导致培养基中细菌的黏附能力和生物膜的合成受损；而抑制BfmS活性，仅能使生物膜的形成能力下降，对下游靶基因没有影响。这表明BfmS并非细菌生物膜合成的必需成分，BfmR也可通过其他途径被激活。Liou等[14]也证明在感受器激酶BfmS失活的情况下，鲍曼不动杆菌ATCC17978株生物膜形成有所减少。2.3细菌QSQS是指细菌在繁殖过程中分泌一些特定的自诱导信号分子，这些信号分子感知周围环境中自身或其他细胞群体密度的变化，并随群体密度增加而增加，当群体密度达到一定阈值时，信号分子启动菌体中特定基因表达，改变和协调细胞之间的行为，从而呈现出某种生理特性。通过QS，可以促进细胞间的信息交流，增强群体合作能力，使其更好地适应外界环境的变化。Niu等[15]研究表明，鲍曼不动杆菌QS受abaI/abaR基因的调控，abaI基因合成自诱导分子乙酰高丝氨酸内酯（acyl-homoserine lactones，AHLs），abaR则合成AHLs的受体。abaI基因为鲍曼不动杆菌密度调控基因，除与细菌毒力与致病性有关外，主要调控细菌群体的密度，在生物膜形成过程中的后期成熟阶段起重要作用，该基因失活可导致生物膜形成损害。鲍曼不动杆菌细胞从浮游状态向生物膜转化过程中，细菌通过产生AHLs分子进行细菌间的信息交流，引起同类细菌的大量聚集。当细菌数达到临界水平，AHLs分子达到阈值，细菌密度感应系统被激活，细菌不断分泌大量胞外多糖（exopolysaccharide，EPS），EPS黏结单个细菌而形成生物膜。而Stacy等[16]证实鲍曼不动杆菌在衰减的群体感应中使用的是非N-酰基丝氨酸内酯，细菌通过QS可以在同种间进行相互协调，也能感知其他种间细菌数量来调控自身行为，不同菌种间相互影响，造成多重感染。AHLs作为QS信号，主要在生物膜形成的中、后期起作用。研究发现[17]，c-di-GMP 可作为鲍曼不动杆菌信号转导过程中的第二信使，与细菌生物膜的形成关系中国感染与化疗杂志2018年1月20日第18卷第1期 Chin J Infect Chemother, January. 2018, Vol. 18, No. 1126密切。低浓度的外源c-di-GMP有利于细菌的运动性和毒性因子的产生，防止细菌黏附，抑制鲍曼不动杆菌生物膜的形成能力。c-di-GMP 对鲍曼不动杆菌生物膜的作用还需进一步研究。Xiang等[18]认为鲍曼不动杆菌临床菌株生物膜形成能力和厚度可能与pgaB转录水平有关，QS基因abaI的表达可能提高pgaB基因的表达，从而导致细胞外基质和生物膜的形成；但孙珊等[19]认为abaI基因在鲍曼不动杆菌临床菌株中存在广泛，并非鲍曼不动杆菌生物膜形成的唯一决定因素。2.4Bap鲍曼不动杆菌Bap是一类含有8621个氨基酸的大分子表面蛋白，可以维持生物膜在非生物表面的成熟结构[20-21]。研究发现[20]，Bap基因突变会导致鲍曼不动杆菌在玻璃表面无法维持生物膜的厚度和体积；Bap具有与细菌表面黏附素相似的结构，推测其可能通过介导细胞间黏附的方式来维持生物膜的成熟结构。SEM分析发现医学材料表面生物膜三维结构和水通道形成需要Bap参与。此外，Bap也可促进鲍曼不动杆菌在人支气管上皮细胞和新生胶质细胞上的黏附，这可能与其增强细菌表面疏水性有关[21]。Bap存在于多种致病菌中，不同细菌的Bap在生物膜形成过程中的作用有所不同。Goh等[22]研究发现，90%被检测菌株含有Bap基因且同源性较高。Bap抗体可抑制阳性株在非生物表面形成生物膜，直接证明Bap在生物膜形成过程中起作用。GEGregorio等[23]对541株鲍曼不动杆菌序列进行分析后发现，Bap具有高度多态性。按照重复序列和羧基端序列差异将Bap分为三种类型，其中29%属于1型，40%属于2型，11%属于3型，另外20%缺少Bap序列。3型Bap只存在于鲍曼不动杆菌，1型和2型也可存在于其他不动杆菌属细菌中。研究发现在鲍曼不动杆菌中存在2个额外蛋白BLP1和BLP2，敲除BLP1或BLP2基因后，鲍曼不动杆菌ST1AYE株生物膜形成明显受影响，生物膜质量和厚度均下降，同时对上皮细胞黏附也受影响。BLP1在多数3型Bap菌株中缺失，而BLP2十分保守，但多数Bap阴性菌株存在缺失。2.5外膜蛋白A外膜蛋白A（outer membrane protein A，OmpA）是鲍曼不动杆菌中最丰富的三聚体外膜孔蛋白，是外膜蛋白的主要成分，主要作用是维持外膜完整性，与细胞黏附、生物膜形成及免疫应答密切相关。Gaddy等[24]研究表明，OmpA对生物膜的形成和发展是非必需的，但在聚苯乙烯表面形成坚固的生物膜需要OmpA，OmpA的失活会导致细菌细胞壁明显改变，这可能是由于外膜的不稳定性造成，并且该过程不依赖CsuA/BABCDE介导的菌毛合成。另外，OmpA也介导鲍曼不动杆菌对人上皮细胞和白念珠菌丝的黏附过程[25]。除了参与细胞黏附外，OmpA还是一种毒力因子，可定位至线粒体产生活性氧，从而诱导上皮细胞死亡，树突状细胞的早发性凋亡和迟发性坏死[26]。此外，OmpA在鲍曼不动杆菌耐药过程中发挥作用，OmpA基因被破坏后使多种药物对鲍曼不动杆菌的MIC降低[27]。2.6blaPER-1基因Lee等[28]研究证实，超广谱β内酰胺酶基因blaPER-1的表达，与鲍曼