北京市清河维A酸受体活性调查及原因物质解析

中国环境科学2010,30(8)：1038~1043ChinaEnvironmentalScience北京市清河维A酸受体活性调查及原因物质解析刘俊,沈路路,巫晓琴,胡建英*(北京大学城市与环境学院,北京100871)摘要：为了研究水环境中维A酸受体活性的成因,于2009年3~7月对清河河道进行了4次采样分析,利用固相萃取柱富集与重组基因酵母结合测试方法,研究了污水排放口上下游河段水样RAR活性的时空变化,并利用高效液相色谱分割活性馏分对原因物质进行了解析.结果发现,清河污水处理厂的上下游部分河段水样具有较高的RARα激活活性,但活性地点位置不稳定,随时间变化.同时,在对原因物质的解析中发现,all-trans-4-oxo-RA和13-cis-4-oxo-RA只是极小部分原因物质,环境水样中依然存在大量的未知RAR活性物质.关键词：类维A酸物质；维A酸受体(RAR)；清河；酵母双杂交测试中图分类号：X172,X835文献标识码：A文章编号：1000-6923(2010)08-1038-06OccurrenceandidentificationofenvironmentalretinoidsinQingRiver,Beijing.LIUJun,SHENLu-lu,WUXiao-qin,HUJian-ying*(CollegeofUrbanandEnvironmentalSciences,PekingUniversity,Beijing100871,China).ChinaEnvironmentalScience,2010,30(8)：1038~1043Abstract：InordertoinvestigateRARagonisticactivityinaqueousenvironment,watersampleswerecollectedfromQingRiver,BeijingineachmonthfromMarchtoJuly,2009.Watersampleswereextractedbysolid-phaseextractcartridgesandtheirRARagonisticactivitiesweretestedbyRARαyeasttwo-hybridbioassay.Afurtheridentificationofenvironmentalretinoidswascarriedoutusinghigh-performanceliquidchromatography.SamplesfromsomelocationsbothupstreamanddownstreamofthesewagetreatmentplantexhibitedunexpectedlyhighRARαagonisticactivities,andthevariationofagonisticactivitywasrandom.Identificationofcausalchemicalssuggestedthatall-trans-4-oxo-RAand13-cis-4-oxo-RAcontributedasmallparttotheRARαagonisticactivity,andtherearestillunknownRARαagonistsinQingRiver.Keywords：retinoids；retinoicacidreceptor(RAR)；QingRiver；yeasttwo-hybridassay全反式维A酸(all-trans-RA)、9-顺式维A酸(9-cis-RA)和13-顺式维A酸(13-cis-RA)是维A酸受体(RARs)和维A酸X受体(RXRs)的内源性配体[1-4],通过与这2类受体结合[5],调控着脊椎和无脊椎动物组织生长和平衡[6-7],体内的类维生素A过量或不足都可能引发动物胚胎的畸变[1,8-9].在已知的维A酸受体的活性配体中,具有致畸作用的化学物质都能选择性地与RAR结合[1].除了天然类维生素A外,大量人工合成化学物质如有机氯农药和一些化工原料也被检测出具有RAR活性[6,10],但是这些人工合成物质诱导RAR活性远低于内源性配体(约100~1000倍)[10].环境中的RAR活性物质作为潜在的致畸物已经引起了科学家的关注[11-13].2003年,Gardiner等[11]在明尼苏达和加利福利亚有畸形青蛙出现的环境水样中检测到了RAR活性,他们怀疑导致该地区青蛙畸形的可能是水中的一系列环境类维生素A物质,但是由于不知道诱导环境中RAR活性的具体化学物质,环境和青蛙畸形的关系至今还是一个谜.Inoue等[12]在日本4条河道中也检测出较高的RARα活性,并发现河道中RAR活性物质可能比已知的雌激素受体(ER)活性物质污染状况更为严重.Zhen等[13]利用RARα重组基因酵母生物测试与HPLC分割相结合的方法,首次在北京城污水样中鉴定出维A酸的2种代谢产物all-trans-4-oxo-RA和13-cis-4-oxo-RA.到目前为止的研究,大多集中在河道水或者城市污水处理厂进出水中RAR活性强度的测试,原因物质的解析仅仅停留在城市污水,自然水体中是否存收稿日期：2009-12-16基金项目：国家自然科学基金资助项目(20777002,20837003)责任作者,教授,[e-mail]8期刘俊等：北京市清河维A酸受体活性调查及原因物质解析1039在不同于城市污水厂的未知RAR活性物质依然不清楚.基于此,本研究于2009年3~7月在清河河道采样,利用固相萃取柱富集与重组基因酵母结合测试方法,研究了污水排放口上下游河段水样RAR活性的时空变化,并利用高效液相色谱分割活性馏分对原因物质进行了初步解析,以期为环境中RAR活性成因的研究提供基础.1材料与方法1.1材料与仪器全反式维A酸(99%,StLouis,USA);二甲基亚砜(DMSO,GC级,北京宝希迪科技有限公司);显色剂4-甲基伞形酮-β-D-葡糖醛酸苷(ONPG,o-Nitrophenyl-β-D-Galactopyranoside,东京化工);溶菌酶Zymolyase20T(SeiagakuCorporation);SD培养基(去除了tryptophan,所有氨基酸都购自sigma公司);YeastNitrogenBase(购自SIGMA);Bio-RAD550酶标仪(ThermoElectronCorpor-ation),Nunc96孔酶标板;JouanMR1822冷冻离心机(购自Sigma公司);恒温培养箱;HPLC级的甲醇,乙酸乙酯,正己烷(FisherChemicalCo.USA);分析纯浓盐酸(购自北京化学试剂公司);Millipore超纯水仪;OASISHLB(500mg6cc)固相萃取小柱(购自美国waters公司);玻璃纤维滤膜(Whatman公司);KL512型氮吹仪;LRH-150生化培养箱(上海一恒科技有限公司).1.2样品的采集和前处理在清河污水处理厂的上下游分别选取了11个采样点(从上游到下游,序号由小变大)(图1),其中6号采样点为清河污水处理厂的出水口.奥运村乡永泰庄清河南镇海淀区清河北京市1234567891011图1北京市清河采样点分布Fig.1DistributionofsamplingsitesinQingRiver,Beijing于2009年3月31日、5月9日、6月25日和7月16日采集清河河道水样品,采样时间尽可能错开下雨时间,采集后的河水样品当天进行处理.取2L水样,用盐酸调节pH值到3.0,依次用6mL正己烷(HEX)、乙酸乙酯(EA)、甲醇(MeOH)和纯水活化HLB固相萃取小柱,然后以约10mL/min的速度上样.整个过程避光操作,富集结束后,HLB固相萃取柱用微弱的N2吹干,然后-20℃冰箱保存.将固相萃取柱依次用6mL正己烷、乙酸乙酯、甲醇进行洗脱,洗脱液分别记作HEX,EA,MeOH馏分,然后将洗脱液在微弱的氮气流下吹干,然后用DMSO定容到400μL,水样的浓缩倍数为5000倍.1.3酵母双杂交活性测试活性测试采用酵母双杂交方法,菌株为SaccharomycescervisiaeY190,由日本大阪大学药学院Nishikawa博士馈赠,菌株上接有人类RARα片段的质粒和共激活因子pGAAD424-TIF2和半乳糖酶报告基因.具体操作按文献[13]报道的方法进行.1.4样品的HPLC分割1040中国环境科学30卷将EA溶解的样品用微弱N2气流吹干后再用甲醇溶解,取100μL进样.WatersSymmetryShieldTM(4.6mm×250mm,粒径5μm)色谱柱用于样品分离分割.流动相为纯水和乙腈,流速为1mL/min,紫外检测器的波长为350nm和254nm.实验采用梯度洗脱方法,0~3min时保持纯水和乙腈分别为80%和20%,随后在3~30min逐步提高乙腈浓度至100%,并保持10min(30~40min),最后在0.1min内将乙腈比率降至20%,淋洗柱子10min(40~50min)直到下一次进样.从0min开始,每隔2min为一个时间段进行分割,每个时间段的样品都保存在5mL的棕色瓶中,一共25个样品,具体分割方法参考文献[13].然后在微弱的氮气流下吹掉乙腈后冻干.再用DMSO定容到100μL,然后用酵母双杂交方法测试每个馏分的活性.1.5UPLC-MS/MS分析用超高效液相色谱-双极质谱仪进一步分析HPLC分割后显示较高活性的15#馏分中all-trans-4-oxo-RA和13-cis-4-oxo-RA的浓度水平.分离柱用Waters的ACQUITYUPLCBEHC18柱(2.1mm×100mm,粒径1.7μm).设置液相色谱柱的柱温为30,℃流速为0.2mL/min.流动相A为0.1%甲酸水溶液,流动相B为乙腈,乙腈比例为60%,检测离子对315137(CollisionEnergy24eV),定性离子对315241(CollisionEnergy15eV),315159(CollisionEnergy15eV),315121(CollisionEnergy30eV),ESI正离子(ESI+)模式分析.2结果与讨论2.1清河RARα活性的时空变化EAMeOHHex1234567891011-1001020ATRA最大响应(%)(a)2009-03-31-1001020ATRA最大响应(%)-101020ATRA最大响应(%)-101020ATRA最大响应(%)123456789101112345678910111234567891011EAMeOHHexEAMeOHHexEAMeOHHex(b)2009-05-09(c)2009-06-25(d)2009-07-16采样点图2清河RARα活性调查结果Fig.2RARαagonisticactivityofwatersamplesfrom11sightsinQingRiver样品浓缩倍数均为50008期刘俊等：北京市清河维A酸受体活性调查及原因物质解析1041酵母双杂交活性测试体系以all-trans-RA作为阳性对照物,将样品的β-半乳糖苷酶值换算为当天all-trans-RA最大响应值的百分比,根据origin非线性拟合的标准曲线计算出all-trans-RA等当量浓度ATRA-EQbio,具体检测结果如图2所示.由图2可见,采样期间所有采样点的HEX(非极性)馏分都没有出现明显活性,活性最高的点均出现在EA(中极性)馏分,这与Zhen等[13]的结果相似.其中,3月31日采集的样品中,1号和4号采样点出现了很高的RAR相对活性,分别达到18.2%和18.1%,ATRA-EQbio分别为2.53,1.96ng/L;5月9日采集的样品中,11号采样点的RAR相对活性达到了20.6%,ATRA-EQbio为3.86ng/L;6月25日的采集点中,6号和11号