饲料中粗蛋白的测定(精)

国家高等职业教育畜牧兽医专业教学资源库1饲料中粗蛋白的测定一、实验目的通过饲料样品中粗蛋白的测定，掌握饲料粗蛋白质含量的测定方法。二、适用范围本方法适用于配合饲料、浓缩饲料和单一饲料。三、实验原理凯氏法测定试样中的含氮量，即在催化剂作用下，用浓硫酸破坏有机物，使含氮物转化成硫酸铵。加入强碱进行蒸馏使氨逸出，用硼酸吸收后，再用酸滴定，测出氮含量，将结果乘以换算系数6.25，计算出粗蛋白含量。四、试剂（1）硫酸：化学纯，含量为98%，无氮。（2）混合催化剂：0.4g硫酸铜，5个结晶水；6g硫酸钾或硫酸钠，均为化学纯，磨碎混匀。（3）氢氧化钠：化学纯，40%水溶液（m/V）。（4）硼酸：化学纯，2%水溶液（m/V）。（5）混合指标剂：甲基红0.1%乙醇溶液，溴甲酚绿0.5%乙醇溶液，两溶液等体积混合，在阴凉处保存期为3个月。（6）盐酸标准溶液：基准无水碳酸钠法标定；①0.1mol/L盐酸标准溶液：8.3mL盐酸注入1000ml蒸馏水中。②0.02mol/L盐酸标准溶液：1.67mL盐酸注入1000ml蒸馏水中。（7）蔗糖：分析纯。（8）硫酸铵：分析纯，干燥。（9）硼酸吸收液：1%硼酸水溶液1000mL，加入0.1%溴甲酚绿乙醇溶液10mL，0.1%甲基红乙醇溶液7mL，4%氢氧化钠水溶液0.5mL，混合，置阴凉处保存期为1个月（全自动程序用）。五、仪器设备国家高等职业教育畜牧兽医专业教学资源库2（1）实验室用样品粉碎机或研钵。（2）分样筛：孔径0.45mm（40目）。（3）分析天平：感量0.0001g。（4）消煮炉或电炉。（5）滴定管：酸式，10、25mL。（6）凯氏烧瓶：250mL。（7）凯氏蒸馏装置：常量直接蒸馏式或半微量水蒸汽蒸馏式。（8）锥形瓶：150、250mL。（9）容量瓶：100mL。（10）消煮管：250mL。（11）定氮仪：以凯氏原理制造的各类型半自动、全自动蛋白质测定仪。六、分析步骤试样的选取和制备:选取具有代表性的试样用四分法缩减至200g，粉碎后全部通过40目筛，装于密封容器中，防止试样成分的变化。（1）仲裁法①试样的消煮称取试样0.5～1g（含氮量5～80mg）准确至0.0002g，放入凯氏烧瓶中，加入6.4g混合催化剂，与试样混合均匀，再加入12mL硫酸和2粒玻璃珠，将凯氏烧瓶置于电炉上加热，开始小火，待样品焦化，泡沫消失后，再加强火力（360～410℃）直至呈透明的蓝绿色，然后再继续加热，至少2h。②氨的蒸馏A.常量蒸馏法将试样消煮液冷却，加入60～100ml蒸馏水，摇匀，冷却。将蒸馏装置的冷凝管末端浸入装有25mL硼酸吸收液和2滴混合指示剂的锥形瓶内。然后小心地向凯氏烧瓶中加入50mL氢氧化钠溶液，轻轻摇动凯氏烧瓶，使溶液混匀后再加热蒸馏，直至流出液体体积为100mL。降下锥形瓶，使冷凝管末端离开液面，继续蒸馏1～2min，并用蒸馏水冲洗冷凝管末端，洗液均需流国家高等职业教育畜牧兽医专业教学资源库3入锥形瓶内，然后停止蒸馏。B.半微量蒸馏法将试样消煮液冷却，加入20mL蒸馏水，转入100mL容量瓶中，冷却后用水稀释至刻度，摇匀，做为试样分解液。将半微量蒸馏装置的冷凝管末端浸入装有20mL硼酸吸收液和2滴混合指示剂的锥形瓶内。蒸汽发生器的水中应加入甲基红指示剂数滴，硫酸数滴，在蒸馏过程中保持此液为橙红色，否则需补加硫酸。准确移取试样分解液10～20mL注入蒸馏装置的反应室中，用少量蒸馏水冲洗进样入口，塞好入口玻璃塞，再加入10mL氢氧化钠溶液，小心提起玻璃塞使之流入反应室，将玻璃塞塞好，且在入口处加水密封，防止漏气。蒸馏4min降下锥形瓶使冷管末端离开吸收液面，再蒸馏1min，用蒸馏水冲洗冷凝管末端，洗液均流入锥形瓶内，然后停止蒸馏。注：上述两种蒸馏法测定结果相近，可任选一种。C.蒸馏步骤的检验精确称取0.2g硫酸铵，代替试样，分别按上述两种步骤进行操作，测得硫酸铵含量为21.19±0.2%，否则应检查加碱、蒸馏和滴定各步骤是否正确。③滴定蒸馏后的吸收液立即用0.1mol/L或0.02mol/L盐酸标准溶液滴定，溶液由蓝绿色变成灰红色为终点。（2）推荐法①试样的消煮称取0.5～1g试样（含氮量5～80mg）准确至0.0002g，放入消化管中，加2片消化片（仪器自备）或6.4g混合催化剂，12mL硫酸，于420℃下的消煮炉上消化1h。取出放凉后加入30mL蒸馏水。②氨的蒸馏采用全自动定氮仪时，按仪器本身常量程序进行测定。采用半自动定氮仪时，将带消化液的管子插在蒸馏装置上，以25mL硼酸为吸收液，加入2滴混合指示剂，蒸馏装置的冷凝管末端要浸入装有吸收液的锥形国家高等职业教育畜牧兽医专业教学资源库4瓶内，然后向消煮管中加入50mL氢氧化钠溶液进行蒸馏。蒸馏时间以吸收液体积达到100mL时为宜。降下锥形瓶，用蒸馏水冲洗冷凝管末端，洗液均需流入锥瓶内。③滴定用0.1mol/L的标准盐酸溶液滴定吸收液，溶液由蓝绿色变成灰红色为终点。7．空白测定称取蔗糖0.5g，代替试样，进行空白测定，消耗0.1mol/L盐酸标准溶液的体积不得超过0.2mL。消耗0.02mol/L盐酸标准溶液体积不得超过0.3mL。八、分析结果的表述计算见下式：%100/25.60140.0）V-V（粗蛋白12VVmc式中：V2——滴定试样时所需标准酸溶液体积，mL；V1——滴定空白时所需标准酸溶液体积，mL；c——盐酸标准溶液浓度，mol/L；m——试样质量，g；V——试样分解液总体积，mL；V’——试样分解液蒸馏用体积，mL；0.0140——与1.00mL盐酸标准溶液[c（HCI）=1.0000mol/L相当的、以克表示的氮的质量。6.25——氮换算成蛋白质的平均系数。九、重复性每个试样取两个平行样进行测定，以其算术平均值为结果。当粗蛋白质含量在25%以上时，允许相对偏差为1%。当粗蛋白质含量在10%～25%之间时，允许相对偏差为2%。当粗蛋白质含量在10%以下时，允许相对偏差为3%。十、注意事项（1）每次测定样本时必须作试剂空白试验。国家高等职业教育畜牧兽医专业教学资源库5（2）凯氏蒸馏在排废液和冲洗反应室时，切断气源的时间不要太长，否则，会造成蒸汽发生器中压力过大，产生不良的后果。（3）在使用蒸馏器时必须进行检查。检查的方法是：吸取5mL0.005mol/L的硫酸铵标准溶液，放入到反应室中，加饱和氢氧化钠溶液，然后进行蒸馏，过程和样本消化相同。滴定硫酸铵蒸馏液所需0.01mol/L盐酸标准量减去空白样消耗标准盐酸的量是5mL，这个蒸馏装置才合标准。（4）消化时如果有黑炭粒不能全部消失，烧瓶冷却后加少量的浓硫酸继续加热，直到溶液澄清为止。十一、其他说明其原因是称取样本量不多，耗用试剂量较少，用于样本消化和蒸馏的时间较短。凯氏大量定氮法亦在某些情况下被采用，其原理与凯氏半微量定氮法相同。前法备有凯氏蒸馏架，凯氏烧瓶（常用250mL或500mL）中样本消化完毕后，即可加入200mL蒸馏水，直接装置在凯氏蒸馏架上全部蒸馏，不须将凯氏烧瓶中消化液转移入容量瓶内，而后再吸取部分稀释液进行蒸馏等手续，这是凯氏大量定氮法的优越性。这个方法适用于测定鲜肉、鲜粪与羊毛中粗蛋白质。说明2：在凯氏定氮法中Meeker和Wagner两氏（Ind.Eng.Chen.,Anal.Ed.5:396,1933）用1%硼酸液10mL替代10mL0.01N盐酸标准液。量取1%硼酸可用普通量筒，因为硼酸与氨的作用仅是一个简单的结合，消化液蒸馏后即可直接用0.01N盐酸标准液滴定蒸馏物。说明3：各种饲料的粗蛋白质中氮的含量，差异很大，变异范围约在14.7-19.5%之间，平均为16%。凡饲料的粗蛋白质中实际含氮量尚未确定的，可用6.25平均系数乘以含氮量换算成粗蛋白质含量。凡饲料粗蛋白质中实际含氮量已经确定的，可用它们的实际系数来换算。例如荞麦、玉米系数6.00，箭舌豌豆、大豆、蚕豆、燕麦、小麦、黑麦用系数5.70，牛奶用系数6.38。说明4：CH3CHNH2COOH为α-氨基丙酸，代表饲料粗蛋白质分解后的一种简单氨基酸，是饲料中有机态氮物质的来源之一。国家高等职业教育畜牧兽医专业教学资源库6说明5：现在分析饲料的粗蛋白质一般多用凯氏半微量定氮法。由于饲料的粗蛋白质含量差异较大，最多的可达80%，最少的仅有1%左右。因此，称取供消化的风干或半干样本重量、稀释消化液的容量及吸取供蒸馏的稀释消化液的容量，均须根据样本粗蛋白质含量的多少而调整，使最后滴定的0.01N标准盐酸液消耗量在5mL之内,便于使用微量滴定管而获得准确的结果。在饲养试验中测定鲜肉、整个鸡体或羊毛的粗蛋白质含量时，为保证采样的代表性，可称取10g鲜畜体样本，用滤纸包裹后放入250mL凯氏烧瓶中，再加0.5g硫酸铜，8~10g无水硫酸钠和30mL浓硫酸，加热消化3~4小时。消化液稀释至250mL，再吸取5mL消化液蒸馏，这样约耗用30mL0.02N标准HCL液。测定家畜粪样粗蛋白质含量时，可取2.5g干样或5~10g湿样，加入0.5g硫酸铜，8-10g无水硫酸钠和30mL浓硫酸进行消化。注6：加入无水硫酸钠（或无水硫酸钾）的目的是提高浓硫酸的沸点，使消化效力提高。纯硫酸的沸点为317℃，加入无水硫酸钠或无水硫酸钾后，硫酸沸点可增至325-341℃。注7：硫酸铜为还原催化剂，其反应原理如下：H2SO42CuSO4+C————→Cu2SO4+SO2↑+CO2↑（有机物质）Cu2SO4+2H2SO4→2CuSO4+2H2O+SO2↑