不同MBR反应器中硝化菌群落结构的研究陈谊

中国环境科学2010,30(1)：69~75ChinaEnvironmentalScience不同MBR反应器中硝化菌群落结构的研究陈谊1,2,孙宝盛1*,张斌1,黄兴1(1.天津大学环境科学与工程学院,天津300072；2.中国石化集团宁波工程有限公司,浙江宁波315103)摘要：采用PCR-DGGE技术研究了正常运行工况下6个不同MBR反应器中的硝酸菌和反硝化菌的群落结构.结果表明,不同的MBR反应器好氧段中硝酸菌之间的相似性较高,相似性数值为78.7%~92.1%,但环境条件、进水水质及运行参数等因素的不同导致了不同MBR反应器硝酸菌群落的差异.MBR反应器中有5种硝酸菌和3种反硝化菌,其中优势硝酸菌种以α-变形细菌(Alphaproteobacteria)、生根瘤菌(Bradyrhizobium)、维氏硝酸菌(Nitrobacterwinogradskyi)为主,反硝化菌以好氧反硝化菌-产碱杆菌属(Alcaligenes)、脱氮副球菌(Paracoccusdenitrificans)、红球菌属(Rhodococcus)为主,说明反应器内同时存在好氧反硝化菌,推断MBR反应器内可能同时存在多种硝化和脱氮途径.关键词：膜生物反应器(MBR)；16SrDNA；微生物群落结构；PCR-DGGE；硝化细菌；测序中图分类号：X172文献标识码：A文章编号：1000-6923(2010)01-0069-07NitrifyingbacteriastructurecommunityofdifferentMBRreactor.CHENYi1,2,SUNBao-sheng1*,ZHANGBin1,HUANGXing1(1.SchoolofEnvironmentalScienceandTechnology,TianjinUniversity,Tianjin300072,China；2.SinopecNingboEngineeringCompanyLimited,Ningbo315103,China).ChinaEnvironmentalScience,2010,30(1)：69~75Abstract：MicrobialcommunitystructureofnitromonasanddenitrifyingbacteriaofsixdifferentMBRswhichwereinnormaloperatingmodewerestudiedbyusingPCR-DGGE.ThenitromonaswereverysimilarindifferentMBRsofaerobicarea,andthesimilarityvalueswere78.7%~92.1%.However,differentenvironmentalconditions,influentwaterquality,operatingparametersandotherfactersresultedindifferentmicrobialcommunityindifferentMBRs.Inaddition,fivekindsofnitromonasandthreekindsofdenitrifyingbacteriawereidentifiedinMBRs,alpha-proteobacteria,bradyrhizobiumandnitrobacterwinogradskyiwerethedominantnitromonas,alcaligenes,paracoccusdenitrificansandrhodococcuswerethedominantdenitrifyingbacteria,aerobicdenitrifyingbacteriaswerefoundintheMBRsystems,theremightbeseveralmodesofnitrificationanddenitrificationinMBRsystems.Keywords：membranebioreactor(MBR)；16SrDNA；microbialcommunitystructure；PCR-DGGE；nitrifyingbacteria；sequencing膜生物反应器(MBR)能有效去除废水中有机物、氨氮和其他较难降解的物质[1],同常规好氧生物处理法相比,具有污泥浓度高、泥龄长、容积负荷高、出水水质好及占地面积小等优点[2-3].目前,MBR已被广泛地应用在生活污水、工业废水及饮用水的处理中[4].在MBR工艺系统中,硝化菌对总氮和氨氮的去除起着决定性的作用,只有充分认识系统内的硝化菌群落结构及其功能,才能优化处理工艺,提高脱氮效果.本课题组前期曾利用PCR-DGGE解析了MBR中微生物的多样性,但只是对总细菌菌群进行了研究[5].本研究利用PCR-DGGE技术和系统发育分析等分子生物学技术,对6个不同MBR的硝化菌的群落结构和功能进行分析和比较,并对其中的硝化菌进行鉴定,以期为优化MBR处理工艺运行,提高脱氮效果提供理论依据.1材料与方法1.1MBR反应器工艺运行工况和取样6个不同MBR反应器的进水水质和处理效果如表1所示,反应器全部采用浸没式处理工艺,水力停留时间为5~8h.均采用聚偏氟乙烯(PVDF)中空纤维膜,膜孔径为0.2μm.间歇出水,出水8min,收稿日期：2009-05-15基金项目：天津市应用基础研究计划项目(07JCZDJC02100)*责任作者,副教授,[e-mail]70中国环境科学30卷曝气2min,气水比为20:1~30:1,采用穿孔曝气管曝气,在提供微生物生长所需要的氧气的同时,能在膜表面形成紊动的气液两相流,可有效延缓膜污染.分别在MBR反应器正常运行工况下取样,取样后立即对污泥做预处理,提取DNA,编号如表1所示,其中G1、G2、G3分别为某MBR反应器缺氧段、好氧段中部和好氧段底部的污泥样品,其他均为好氧段的污泥样品.CODCr、氨氮、总氨、SS等参照标准方法测定[6].1.2污泥样品的预处理与总DNA的提取1.2.1污泥样品预处理取500mL均匀的污泥混合液,静沉30min后,弃去上清液,取沉淀部分50mL于50mL灭菌离心管内,在6~10℃、9165×g离心10min;弃去上清液,再加入30mL灭菌的超纯水振荡混匀,9165×g离心10min.重复超纯水振荡离心步骤1次;弃去上清液,加入30mL灭菌的TE缓冲液混匀,9165×g离心10min;弃去上清液后,将所得的沉淀污泥加入15mL灭菌的超纯水振荡混匀,取5mL污泥样品提取基因组DNA.表1MBR反应器工艺运行工况和取样Table1ProcessoperatingconditionsofMBRandsamplingCODCr(mg/L)氨氮(mg/L)总氨(mg/L)SS(mg/L)MBR反应器进水出水进水出水进水出水进水出水取样编号某加工区再生水厂MBR反应器260~4005020~35520~4015160~2200G1、G2、G3某加工区MBR小试实验装置260~4004020~35520~408160~22011G4某雨污水MBR实验装置150~3003010~20520~3510120~1800G5医院污水MBR反应器200~4506030~40660~9020G6学生公寓污水MBR处理系统220~3805012~20518~351080~2200G7游泳馆洗浴污水MBR反应器250~4005010~155100~2005G81.2.2污泥DNA提取方法采用化学裂解-酚/氯仿/异戊醇抽提试剂盒纯化的方法提取总基因组DNA,具体提取方法参见文献[7].1.3基因组DNA16SrDNAV3区PCR扩增1.3.1硝酸菌的巢式PCR扩增第1轮采用对硝酸菌特异性的引物对FGPS1269和FGPS872,及相应的反应体系和程序[8].第2轮PCR以第1轮PCR产物作为模板,使用引物F357-GC和R518,及相应的反应体系和程序[9].使用巢式PCR进行连续2轮扩增.1.3.2反硝化菌的巢式PCR扩增反硝化菌同样采取巢式PCR扩增,第1轮采用反硝酸菌特异性的引物对nirK-1F和nirK-5R,及相应的反应体系和程序[10].第2轮PCR以第1轮PCR产物作为模板,使用引物F357-GC和R518进行扩增,扩增程序和反应体系同硝酸菌的第2轮过程.以上PCR产物经1.5%琼脂糖电泳检测表明,得到扩增目的片段.1.4PCR产物的DGGE分析采用C.B.S.SCIENTIFICDGGE-2001系统对细菌PCR产物进行变性梯度凝胶电泳分离,凝胶浓度为8%,变性梯度为35%~55%.待胶完全凝固后,将胶板放入装有1×TAE电泳缓冲液的装置中,在每个加样孔加入含有10%的1×TAE缓冲液的PCR样品20μL.150V,60℃下电泳6.5h[11-12].1.5微生物Shannon-Wiener多样性指数应用凝胶分析软件QuantityOne对扫描所得的DGGE图谱进行分析,并利用Shannon多样性指数(H)来评价MBR反应器在各个阶段微生物的多样性情况.H计算公式为:1期陈谊等：不同MBR反应器中硝化菌群落结构的研究711logsiiiHpp==−∑(1)式中:pi=ni/N,其中ni为峰面积,N为所有峰总面积.1.6DGGE凝胶片段的回收及测序分析切割DGGE胶上主要的条带溶于50μLTE缓冲液,4℃下静置过夜,取3μL的浸出液作为模板,以F357和R518为引物进行PCR扩增.PCR反应程序同硝酸菌第2轮扩增,退火温度改为55℃.PCR产物在1.5%琼脂糖凝胶中电泳检测,DGGE鉴定为单一条带后,送至上海生工生物技术有限公司进行测序.1.7同源性分析与系统进化树构建使用Sequin软件对测序结果进行处理,一次性提交给GenBank数据库,采用BLAST将目标序列和基因库中所含序列进行同源性分析比对.采用DNAMAN(V5.2.2版)进行系统发育树分析.2结果与讨论2.1不同MBR反应器内硝酸菌群落结构的比较2.1.1硝酸菌群落结构的DGGE图谱由图1可见,MBR反应器中硝酸菌群落都比较丰富,6个不同的MBR反应器既含有相同的硝酸菌,又有特有的硝酸菌,体现了MBR工艺的共同性和差异性.条带A、B、C、E、F、G、H和L所代表的硝酸菌是不同MBR反应器共有的菌种,浓度均较大,说明这些硝酸菌种在各自的反应器中都比较丰富,是硝化作用的主体微生物.不同的MBR反应器共有8、9种硝酸菌,说明MBR反应器的硝酸菌具有很多类似之处,MBR反应器特有的污泥截留作用形成了较长的污泥停留时间,一方面,使得大量的硝酸菌能得到繁殖;另一方面,这些硝酸菌能长期稳定的停留在反应器中而不会随出水流失.在大多数MBR反应器中出现条带D、I、J、K所代表的硝酸菌,且浓度较低,说明这类硝酸菌的共性和优势地位较差.条带a、b、c、d所代表的硝酸菌是少数几个反应器共有的微生物.条带a在污泥样品G1、G2、G3、G4中出现,它们为处理相同污水的MBR反应器的污泥,说明该硝酸菌是该污水环境下培养驯化出来的.条带g、h、i、j、k、l、m所代表的硝酸菌是对应的MBR反应器中特有的硝酸菌,与MBR反应器的进水污水水质和运行条件有关,反应器长期运行驯化出特有的硝酸菌,这是微生物对环境的一种适应和调整.ABCDEFGHIJKLG1G2G3G4G5G6G7G8jkabcdghilm图1不同MBR污泥样品中硝酸菌的DGGE谱图Fig.1DGGEprofileofnitrobacterbacteria2.1.2硝酸菌H分析由表2可见,同一MBR反应器内污泥样品G1、G2、G3的H分别为0.88,1.00,0.97,缺氧段的H较低,硝酸菌作为好氧微生物在缺氧段较低的溶解氧条件下受到抑制,72中国环境科学30卷其H低于好氧段.处理相同污水的MBR装置的污泥样品G2和G4的H分别为1.00和1