不同测定方法探讨重金属对微生物毒性的影响

生态环境学报2019,28(1):[e-mail]基金项目：闽西职业技术学院环保技术服务平台项目（2015LY06）作者简介：梁玉兰（1976年生），女，副教授，主要研究方向为环境监测与治理。E-mail:[e-mail]收稿日期：2018-09-10不同测定方法探讨重金属对微生物毒性的影响梁玉兰1，张小华21.闽西职业技术学院，福建龙岩364021；2.江苏大学食品与生物工程学院，江苏镇江212013摘要：微生物是污水处理工艺中污染物的重要分解者，重金属对活性污泥微生物具有一定毒性。为了研究和比较重金属对活性污泥微生物的毒性影响，采用发光细菌毒性、活性污泥脱氢酶毒性、硝化抑制毒性3种方法测定4种重金属（Hg、Cd、Zn、Pb）对活性污泥微生物的毒性，并对测定结果进行了比较。结果表明，4种重金属均可降低污泥系统CODCr的去除率，其中，Cd和Hg对CODCr去除率的影响最明显（43.2%－92.3%和52.4%－92.5%），而Pb和Zn对活性污泥CODCr去除率的影响较小。发光细菌毒性测定方法的灵敏度最高（达50%以上），测得的重金属半数有效浓度（EC50）最低（Hg9.6mg·L−1，Cd0.3mg·L−1，Zn3.6mg·L−1，Pb13.9mg·L−1），4种重金属对发光细菌发光强度的抑制程度表现为HgCdZnPb，发光细菌的发光强度抑制率与重金属的对数浓度呈极显著的线性相关关系（P0.01），发光细菌发光强度随重金属对数浓度的增大而减小。活性污泥脱氢酶毒性和硝化抑制毒性的测定结果与发光细菌毒性测定结果相比，灵敏度相对较低，测得的重金属EC50相对较高，活性污泥脱氢酶活性的抑制程度大小顺序为CdHgZnPb，与测得的活性污泥硝化速率抑制程度大小顺序一致，但二者测得的EC50有所差别。4种重金属与活性污泥脱氢酶活性的Logistic回归方程均达到极显著水平（P0.01），活性污泥SVI值随重金属浓度的增加而升高，当重金属浓度较低时，其对活性污泥SVI的影响并不大。为了更准确地判定重金属对活性污泥微生物的毒性影响，应取不同的重金属毒性终点指示指标进行毒性组实验，而不能以发光细菌毒性的单一测定结果作为评判依据。关键词：重金属；发光细菌；脱氢酶；硝化抑制DOI:10.16258/j.cnki.1674-5906.2019.01.018中图分类号：X703文献标志码：A文章编号：1674-5906（2019）01-0152-08引用格式：梁玉兰,张小华,2019.不同测定方法探讨重金属对微生物毒性的影响[J].生态环境学报,28(1):152-159.LIANGYulan,ZHANGXiaohua,2019.Effectofheavymetalsonmicrobialtoxicitybydifferentmeasuringmethod[J].EcologyandEnvironmentalSciences,28(1):152-159.随着工业化进程的加快，各大城市纷纷建立工业区集中水处理设施，减轻了城市污水处理系统及地表水的负担（王凯军等，2001；余杰等，2007；Vachovápetal.，2017）。然而，受到城市规划的历史影响，有时工业废水会流入城市生活污水处理系统中，容易对其中的微生物造成影响，并且降低活性污泥的处理效率。在城市废水的集中生化处理过程中，活性污泥法由于低价高效而被普遍使用。而活性污泥法中，微生物是有机污染物的主要分解者，当重金属存在时，会对活性污泥处理系统造成很大影响（赵庆良等，2006；竺建荣等，1999；Goronszyetal.，1996）。活性污泥法被广泛应用于城市污水和工业废水的集中生化处理中，其本质是污泥微生物通过氧化水中的有机物质，产生维持自身生存和增长的能量，同时达到降解有机物、净化水质的目的（竺建荣等，1999；Rodrãguezetal.，2018），这也是防止工业污水进入城市污水处理系统的最主要手段之一。因此，活性污泥法被广泛应用于城市废水的集中生化处理过程中。在活性污泥生物处理过程中，微生物生命活动需要大量的营养物质，其中就包括作为酶的活性剂与活化剂的微量重金属（刘锐等，2001；李娟英等，2009；Jacobetal.，2018）。微生物是污水处理工艺中污染物的重要分解者，重金属对活性污泥微生物的毒性研究也一直备受关注（李娟英等，2009；刘新春等，2005），重金属对微生物的毒害作用可导致处理系统的微生物种群结构发生改变，影响污水处理效果。近年来不少学者开展了重金属毒性带来的污水处理影响机理，并提出了相应的检测方法，探究重金属对微生物结构和活动产生的作用（蒋成爱等，2001；吕锡武，2001），但是所提出的观点不尽一致，研究视角也不尽相同。由于测定方法不统一，且每种方法都有其优缺点和适用条件，导致很多的研究结论差别很大，有的甚至相互矛盾（谢冰等，2003；Wei梁玉兰等：不同测定方法探讨重金属对微生物毒性的影响153etal.，2010；Miśkowiecetal.，2015；Yangetal.，2018）。从目前的研究成果来看，在重金属对生态环境的毒性影响方面最常用的毒性测定方法是生物试验法，即通过生物体或细胞的存活时间和繁殖量来判断毒性的大小，从而获得重金属毒性的相关信息。由于重金属对活性污泥微生物的毒性与化学反应速率和微生物生长速率有关，单一采用生化法或生物法测得的结果无法为活性污泥工艺运行提供科学指导。鉴于此，笔者以活性污泥为受试对象，研究了4种常见重金属对污泥活性及微生物的影响，尝试运用不同测定方法来研究重金属对活性污泥微生物的毒性，以期为污水生物处理工艺运行和设计管理提供理论依据。1材料与方法1.1试验材料药剂：ZnCl2、PbCl2、CdCl2、HgCl2、CuSO4、Pb(NO3)2、Hg(NO3)2、氯化三苯基四氮唑（TTC）标准溶液，均为分析纯。细菌：502发光细菌冻干粉，来源于福建省农科院。活性污泥：活性污泥脱氢酶毒性实验和硝化抑制毒性实验中所用活性污泥分别取自城市污水处理厂A/O工艺的A段和O段（具有硝化功能的活性污泥）。该污水处理厂接纳的污水中，90%是生活污水，10%为工业污水，主要包括食品加工厂、物流冲洗污水和餐饮污水，挥发性悬浮固体（VSS）浓度与总固体悬浮物（SS）浓度之比约为0.71，污泥沉降指数（SVI）为78－109，pH为7.8。模拟废水：采用葡萄糖、奶粉、磷酸二氢钾、氯化铵配制，4种物质的比例为20꞉5꞉5꞉1，CODCr为600mg·L−1左右，NH4+-N浓度为50mg·L−1，4℃保存。重金属溶液：配制重金属浓度为1.0g·L−1的溶液，备用。主要仪器：ET-99718微电脑化学需氧量测定仪；YSI-5000DO测定仪；岛津UV-2450紫外可见分光光度计。1.2试验方法1.2.1一次暴露试验取离心（3000r·min−1，20℃）后的活性污泥30g加入1500mL曝气反应器中，然后分别加入含不同浓度重金属的模拟废水1000mL，充氧曝气24h，反应后采用MLSS型悬浮物（污泥）浓度计（德国，MLSS10AC+MLSS-S0C10）测定该活性污泥系统的污泥沉降指数（SV30）、活性污泥中悬浮固体含量（MLSS），并计算污泥体积指数（SVI）：SVI=SV30/MLSS；使用显微镜观察污泥中的生物相；静置沉淀60min后取上清液测CODCr值；最后测定反应后活性污泥的脱氢酶活性、活性污泥的耗氧速率（活性污泥耗氧速率测定仪，美国，AER-208），所有试验维持曝气量不变。1.2.2中毒污泥二次培养试验采用二次培养试验检验重金属中毒活性污泥经短时间培养后的活性恢复情况。从曝气反应器中取出活性污泥混合液，离心后弃上清液。并使用蒸馏水洗涤3次，加入不含重金属的模拟废水，曝气反应24h，然后测定废水CODCr值及活性污泥的耗氧速率。CODCr采用快速COD测定仪检测；耗氧速率采用YSI5000DO测定仪测定；脱氢酶活性采用岛津UV-2450紫外可见分光光度计测定，其作用原理为：无色的2,3,5-三苯基四氮唑氯化物在脱氢酶作用下可转化为红色的三苯甲基（TF），因此，通过检测TF的产生量可间接评价污泥脱氢酶的活性。1.2.3活性污泥脱氢酶毒性测定（1）TTC标准曲线绘制（李光伟等，2007）分别取TTC质量浓度为0、20、40、60、80、100、120、140μg·mL−1的标准溶液各1.0mL，置于10mL离心管中，再加入2mL三羟甲基氨基甲烷盐酸盐（Tris-HCl）缓冲溶液、1mL质量分数为10%的Na2S溶液和1mL蒸馏水；将离心管置于37℃恒温水浴中振荡30min，加入0.5mL甲醛，再加入5mL质量分数为80%的丙酮，在37℃恒温水浴振荡10min，萃取完毕后，于4000r·min−1离心5min，取上清液于分光光度计485nm处测定吸光度；以TTC质量浓度为横坐标，以吸光度为纵坐标绘制标准曲线，通过标准曲线计算TTC还原产物三苯甲基（TF）的生成量。（2）活性污泥脱氢酶毒性试验将活性污泥先曝气24h，以保证所有外源基质被耗尽，然后取适量污泥混合液，用蒸馏水洗涤2次后加水稀释，将MLSS控制在2000mg·L−1左右，从中取一系列体积为50mL的污泥混合液样品，并测定样品的初始活性污泥脱氢酶活性；为消除pH对实验结果的影响，用磷酸盐缓冲溶液将样品的pH调节为7.2；根据样品的重金属浓度梯度，向样品中加入不同量的重金属化合物，并保持样品总体积不变；将样品振荡2h后，测定抑制后的活性污泥脱氢酶活性，同一污泥混合液样品平行测定3次。取1mL污泥混合液样品置于10mL离心管中，依次加入2mLTris-HCl缓冲溶液、0.5mL质量浓度为0.1mol·L−1的葡萄糖溶液和0.5mL质量分数为0.4%的TTC溶液；并迅速将制备好的样品放置于37℃恒温水浴中振荡2h，然后加入0.5154生态环境学报第28卷第1期（2019年1月）mL甲醛终止反应；于4000r·min−1离心5min后去除上清液，加入5mL萃取剂，于37℃恒温水浴振荡10min；萃取完毕后再于4000r·min−1离心5min，取上清液于分光光度计485nm处测定吸光度；取经离心的沉淀污泥在105℃烘干2h测其质量。活性污泥脱氢酶活性的计算如下（周立祥等，2001）：485iETS=ttDVkW（1）式中，ETS为脱氢酶活性，单位为μg·mg−1·h−1；D485为485nm处吸光度；V为萃取剂体积，单位为mL；ki为TTC曲线斜率；W为陈定污泥干质量，单位为mg；t为脱氢酶培养时间，单位为h。通常借助Logistic方程计算重金属影响下的脱氢酶活性，具体公式如下：=1+kyxbxo（2）式中，x为重金属的质量浓度，mg·L−1；y为TF的质量浓度，μg·mL−1；x0为重金属的半数有效浓度（EC50），mg·L−1；k为x=0时所对应的y值，即是空白对照组的TF，μg·mL−1；b为经验系数。1.2.4硝化抑制毒性测定（1）硝化抑制毒性实验以富集培养的活性污泥作为受试对象，测定在不同浓度重金属影响下的活性污泥硝化速率。所有实验均在恒温20℃水浴锅中进行，在水浴锅中放置1000mL的大口试剂瓶作为反应器，pH控制在8.0左右，水中DO保持在4.0－5.0mg·L−1。在反应器中加入不同浓度的重金属化合物，并间隔一定的时间取适量体积的污泥混合液样品，分别测定氨氮浓度并绘氨氮浓度随反应时间的变化图。（2）数据处理对氨氮浓度随反应时间的变化图进行求导，得出不同重金属浓度条件下的活性污泥硝化速率，再根据重金属浓度对硝化速率影响的修正Monod方程求重金属的EC50。其计算公式为（周立祥等，2000；Miśkowiecetal.，2015）：=axqpx+（3）式中，q为硝