不同电子受体除磷污泥相似性与菌群结构研究

中国环境科学2014,34(4)：935~941ChinaEnvironmentalScience不同电子受体除磷污泥相似性与菌群结构研究吕小梅1,李继1,2,3*,李朝林1,刘洞阳1,邵明非1,2,3,夏雪1(1.哈尔滨工业大学深圳研究生院,广东深圳518055；2.深圳水资源利用与环境污染控制重点实验室,广东深圳518055；3.深圳市城市废弃物能源再生公共技术服务平台,广东深圳518055)摘要：分别以硝酸盐、亚硝酸盐、氧气为电子受体,采用3组SBR反应器培养除磷污泥,连续126d的稳定运行表明:以硝酸盐、亚硝酸盐、氧气为电子受体除磷污泥对TP平均去除率分别为84.8%,78.7%,87.4%,出水TP平均浓度分别为0.758,0.931,0.632mg/L.采用高通量测序技术对不同电子受体除磷污泥的相似性与菌群结构进行了研究,结果表明,以硝酸盐,亚硝酸盐为电子受体的反硝化除磷污泥具有近似的菌群结构,与好氧除磷污泥菌群结构差异较大.基于各样品主导OTUs序列的系统发育关系及其比例的分布,主导微生物主要可以分为5个簇.通过序列比对,在97%的序列相似度条件下,种泥中聚磷菌与聚糖菌序列比例为0.716%与0.368%,以硝酸盐、亚硝酸盐、氧气为电子受体除磷污泥中聚磷菌与聚糖菌序列比例分别为1.78%,2.53%,4.80%与1.44%,1.32%,30.9%,厌氧-缺氧条件有利于抑制聚糖菌.亚硝酸盐为反硝化除磷污泥电子受体时潜在公共卫生安全隐患.关键词：除磷污泥；电子受体；相似性；菌群结构中图分类号：X703.1文献标识码：A文章编号：1000-6923(2014)04-0935-07Microbialsimilarityandcommunitystructureofphosphorusremovalsludgewithdifferentelectronacceptors.LVXiao-mei1,LIJi1,2,3*,LIChao-lin1,LIUDong-yang1,SHAOMing-fei1,2,3,XIAXue1(1.HarbinInstituteofTechnologyShenzhenGraduateSchool,Shenzhen518055,China；2.ShenzhenKeyLaboratoryofWaterResourceUtilizationandEnvironmentalPollutionControl,Shenzhen518055,China；3.ShenzhenPublicTechnologicalServicePlatformforUrbanWasteEnergyRegeneration,Shenzhen518055,China).ChinaEnvironmentalScience,2014,34(4)：935~941Abstract：Phosphorusremovalsludgewithnitrate,nitriteandoxygenasthesoleelectronacceptorwereacclimatizedinthreeparallelsequencingbatchreactors,namelyRN03,RN02andR02respectively.Operationresultsshowedthatphosphorusremovalrateswere84.8%,87.4%and78.7%onaverageforRN03,RN02andR02,witheffluentTPconcentrationof0.758mg/L,0.931mg/Land0.632mg/L.High-throughputtechnologywasemployedtoevaluatethemicrobialsimilarityandcommunitystructureofphosphorusremovalsludgewithdifferentelectronacceptors.Resultsindicatedthatdenitrifyingphosphorusremovalsludgewithnitrateandnitriteaselectronacceptorsexhibitedsimilarbacterialcommunitystructureandwasdistinctfromthatofaerobicphosphorusremovalsludge.ThedominantmicrobialorganismswereclusteredintofivecladesbasedonthephylogeneticrelationshipofthesignificantOTUssequences.ThroughsequenceBLAST,0.716%,1.78%,2.53%and4.80%ofsequencesfromSeed,RN03,RN02andR02couldbeassignedtoAccumulibacter-likesequencesatsimilaritylevelof97%;0.368%,1.44%,1.32%and30.9%ofsequencescouldbeassignedtoGAO-likesequences,indicatingthatalternatinganaerobic-anoxicconditionwasfavorabletowardeliminationofGAO.Moreover,potentialpublichealthhazardwasrevealedfornitritebaseddenitrifyingphosphorusremovalsludge.Keywords：phosphorusremovalsludge；electronacceptor；similarity；communitystructure强化生物除磷(EBPR)被认为是最经济有效且环境友好的生物除磷技术.在该工艺中,通过交替的厌氧-好氧环境,除磷菌(PAO,phosphorusaccumulatingorganisms)能够得到富集并发挥除磷效能.除了厌氧-好氧条件外,厌氧-缺氧条件下磷同样能够得到去除[1-3].人们将这类在厌氧-缺氧条件下能够除磷的微生物称之为反硝化除磷收稿日期：2013-08-15基金项目：国家水污染控制与治理重大专项(2012ZX07313001).*责任作者,教授,[e-mail]936中国环境科学34卷菌(DPAO,denitrifyingphosphorusaccumulatingorganisms),因其能够实现同步脱氮除磷,因而对低碳氮污水的处理具有重要的意义.目前对于反硝化除磷的研究主要集中在以硝态氮为电子受体的反硝化除磷的研究,结果表明,硝态氮是合适的反硝化除磷污泥电子受体,且有利于节约曝气,降低除磷脱氮对碳源的需求[4-5],节约运行成本.因而,研究人员致力于开发反硝化除磷工艺或在原有除磷工艺基础上最大化实现反硝化除磷[6-7,3].另一方面,作为反硝化过程的中间产物,亚硝氮同样可以作为反硝化除磷污泥的电子受体[8-11].不同形式的基于亚硝氮反硝化除磷工艺均具有良好的脱氮除磷效果,亚硝氮为电子受体的反硝化除磷工艺的研究对强化生物除磷技术的革新具有重要意义.尽管反硝化除磷得到了广泛的研究,然而,由于环境中绝大部分微生物是不可培养的,而采用现代分子生物学技术的研究也主要是针对厌氧-好氧环境中的好氧除磷污泥.利用不同电子受体吸磷的除磷菌是否属于同一类细菌,目前仍然存在较大争议.针对除磷菌分类,目前研究主要是通过宏观表现出来的吸磷特性进行定性[12-14],不能从本质上揭示原因.为此,本研究采用基于高通量测序的分子生物学技术,研究采用不同电子受体(硝酸盐,亚硝酸盐,氧气)除磷污泥的相似性与菌群结构,为除磷污泥的分类与研究提供理论基础.1材料与方法1.1试验装置采用3个平行的SBR反应器(图1),分别以硝酸盐(RN03),亚硝酸盐(RN02),氧气(R02)为电子受体培养不同除磷污泥.RN03与RN02采用厌氧-缺氧方式运行,R02采用厌氧-好氧方式运行.SBR反应器有效体积为6.5L,每天运行3个周期(8h/周期),包括:进水(0.25h),厌氧(2.5h),缺氧或好氧(4.0h),沉淀(1.0h),排水(0.25h).对于厌氧-缺氧反应器(RN03与RN02),厌氧释磷后,采用蠕动泵在缺氧段的前1.0h连续投加硝酸盐或亚硝酸盐进行反硝化吸磷.对于厌氧-好氧反应器(R02),好氧段采用曝气泵进行曝气(流量为0.3m3/h).为保证污泥充分混合,在厌氧与缺氧(或好氧)阶段,采用搅拌器进行搅拌(转速为40r/min).进水、搅拌、曝气、沉淀、排水等操作均采用时间控制器进行程序切换.厌氧初,将泥水混合液pH值调节至7.0左右,其他阶段不再调节,出水pH值一般为7.6~7.8.氮气空气进水口进水口出水口出水口排泥口搅拌器曝气头搅拌器曝气头排泥口(a)厌氧-缺氧反应器(b)厌氧-好氧反应器投加硝氨/亚硝氨图1SBR装置示意Fig.1SBRequipment(a)硝酸盐或亚硝酸盐为电子受体;(b)氧气为电子受体每个运行周期结束后,从反应器排出4L上清液,并补充等量的人工配水,因而反应器水力停留时间(HRT,hydraulicretentiontime)为13h.RN03,RN02,R023个反应器污泥停留时间(SRT,sludgeretentiontime)控制在15~20d.反应器在室温条件下运行(平均14.4~27.7℃),运行过程中连续取样监测反应器运行效能.1.2接种污泥与进水水质SBR反应器的接种污泥取自深圳市罗芳污水处理厂(A2/O工艺)二沉池回流污泥.接种污泥的SVI(sludgevolumeindex)为105mL/g,以硝酸盐,亚硝酸盐,氧气为电子受体时吸磷量分别为0.80,0.38,1.3mgP/gVSS.进水采用人工配水,每2天配水1次,以保证配水水质不会发生明显变化.每1L配水中包括:200mgCH3COONa,14mgNH4Cl,20mgNaH2PO4与0.3mL微量元素溶液.每1L微量元素包括:10gEDTA,0.12gZnSO4·7H2O,0.12gMnSO4·7H2O,0.03gCuSO4·5H2O,1.0gFeCl3,0.06g(NH4)2Mo4O13·2H2O,0.15gCoCl2·6H2O,0.15gH3BO3与0.18gKI.另外,按1:10的体积比4期吕小梅等：不同电子受体除磷污泥相似性与菌群结构研究937例向配水中补加经过初级沉淀后的生活污水(深圳大学城校区内生活污水,其水质见文献[15]).配水中,COD约150mg/L,NH4+-N约5.0mg/L,TP约6.0mg/L.1.3水质分析方法1.3.1常规指标分析方法COD,TP,MLSS采用国家标准方法测定.COD测定采用重铬酸钾滴定法,TP测定采用钼酸盐分光光度法,MLSS测定采用重量法.NH4+-N,NO3--N与NO2--N浓度测定采用Cleverchem200自动化水质分析仪(DeChem-Tech.Gmbh,Germany).1.3.2DNA提取,PCR扩增与高通量测序污泥样品包括接种污泥(Seed),接种运行第100d时3个SBR中污泥.采用FastDNA®土壤试剂盒(MPBiomedicals,Illkirch,France)进行细菌组DNA提取.16SrRNA基因V6区序列采用引物对967F(CAACGCGAAGAACCTTACC)与1046R(CGA-CAGCCATGCANCACCT)进行扩增[16].30uLPCR反应体系包括:0.75uL的MightyAmp®DNA聚合酶(TaKaRa,大连),15µL的2×Buffer,1.5µL的前后引物,以及20~50ng细菌组DNA,最后采用ddH2O补足至30uL.PCR扩增采用i-Cyc