不同短程硝化系统中微生物群落结构的对比分析侯爱月

中国环境科学2016,36(2)：428~436ChinaEnvironmentalScience不同短程硝化系统中微生物群落结构的对比分析侯爱月,李军*,卞伟,王盟,郑林雪,张彦灼,赵昕燕(北京工业大学水质科学与水环境恢复工程北京市重点实验室,北京100124)摘要：为探讨有机碳源对短程硝化系统中微生物群落结构的影响,采用构建克隆文库的方法对模拟无机城市生活污水和模拟实际城市生活污水短程硝化系统中的微生物群落结构进行对比分析.实验结果表明,变形菌门(Proteobacteria)和未培养菌(unculturedbacterium)是两系统中的优势菌群.两系统中的菌群结构存在差异,但优势菌群及其所占比例相似.两系统中的主要脱氮菌类群也相似,但由于有机碳源浓度的不同其菌属及比例有所差异.无机短程硝化系统中的脱氮菌群包括亚硝化单胞菌属(Nitrosomonas)、硝化螺菌属(Nitrospira)和Denitratisoma,其中自养硝化菌的比例高于其在有机短程硝化系统中的比例,但仍低于异养菌在该系统中的比例.有机短程硝化系统中的脱氮菌群主要包括β-Proteobacteria中的一些反硝化细菌和亚硝化单胞菌属(Nitrosomonas),其中亚硝化单胞菌属(Nitrosomonas)的含量很少.关键词：有机碳源；短程硝化；克隆文库；微生物群落结构中图分类号：X172文献标识码：A文章编号：1000-6923(2016)02-0428-09Analysisofmicrobialcommunitystructureindifferentpartialnitrificationsystem.HOUAi-yue,LIJun*,BIANWei,WANGMeng,ZHENGLin-xue,ZHANGYan-zhuo,ZHAOXin-yan(KeyLaboratoryofBeijingforWaterQualityScienceandWaterEnvironmentRecoveryEngineering,BeijingUniversityofTechnology,Beijing100124,China).ChinaEnvironmentalScience,2016,36(2)：428~426Abstract：Inordertostudytheinfluencesoforganiccarbonsourceonthemicrobialcommunitystructureinpartialnitrificationsystem,themicrobialdiversitywasinvestigatedintwopartialnitrificationreactorsbytheconstructionofbacterialclonelibrary.Theinfluentsoftworeactorswereartificialwastewaterwithandwithoutorganiccarbonsource,respectively.TheresultsindicatedthatProteobacteriaandunculturedbacteriumwerethedominantbacteriaofthetwostudiedsystems.Thedifferencesexistedinthestructureofthebacterialcommunityofthetwosystems.Nonetheless,thedominantbacteriaandtheirproportionsweresimilartoeachotherinthetotalclones.Inaddition,themaindenitrifergroupswerealsosimilarinthetwosystems.Duetothedifferentconcentrationsoforganiccarbonsource,thedenitrifergeneraandtheirproportionsweredistinct.ThemaindenitrifergeneraofpartialnitrificationreactorwithinorganicwastewaterwereNitrosomonas,NitrospiraandDenitratisoma.Theproportionofautotrophicnitrifyingbacteriainpartialnitrificationreactorwithinorganicwastewaterwashigherthanthatwithorganicwastewater.Butinthereactorwithinorganicwastewater,theproportionofautotrophicbacteriawaslowerthanheterotrophicbacteria.Themaindenitrifergeneraofpartialnitrificationreactorwithorganicwastewaterweresomedenitrifyingbacteriaofβ-ProteobacteriaandNitrosomonas.Additionally,theproportionofthelatterinthisreactorwasrelativelylow.Keywords：organiccarbon；partialnitrification；clonelibrary；microbialcommunitystructure与全程硝化相比,短程硝化可减少25%的硝化需氧量和40%的反硝化碳源,具有较低的污泥产量,并且可减少反硝化池容积[1-4],成为近几年新型生物脱氮工艺的研究热点.国内外有关短程硝化的研究多用于处理污泥消化液、垃圾渗滤液等高氨氮废水[5-6],并已有工程应用,而基于城市生活污水的短程硝化研究则多局限于实验室水平,有待于进一步深入.硝化过程是由氨氧化菌(AOB)和亚硝酸盐氧化菌(NOB)这两种菌群的生化作用完成,可以通过控制各种影响因素促进AOB的生长繁殖而抑制NOB的生长实现短程硝化[7-8].微生物在硝化过程中起着至关重要的收稿日期：2015-07-10基金项目：国家水体污染控制与治理科技重大专项资助项目(2014ZX07201-011)*责任作者,教授,[e-mail]2期侯爱月等：不同短程硝化系统中微生物群落结构的对比分析429作用,深入研究污泥中微生物群落结构有助于加强对硝化过程机理的理解,进而为工艺的优化控制和稳定运行提供更加全面的参考和依据.目前国内外关于短程硝化的研究多集中在短程硝化的工艺运行及优化方面,李凌云等[9]对短程硝化的启动条件进行了优化,苏东霞等[10]进行了不同曝气方式SBR短程硝化试验.有关进水水质对短程硝化系统中微生物群落结构的研究较少,赵志瑞等[11]为探讨短程硝化系统中的微生物对不同污水的适应性,利用分子生物学技术对高氨氮废水和城市生活污水短程系统中活性污泥的细菌群落结构进行了比较.C、N是生活污水中最主要的两大污染元素,目前运用比较多的污水处理工艺(AO、AAO等)均是将硝化系统与反硝化系统分开,这样硝化系统中主要以N源为主,反硝化系统中以C源为主.但是,随着短程硝化技术的成熟以及对高脱氮率的追求而设置的高回流比,使得有机碳源可能进入硝化系统.另外,许多脱氮新工艺的出现,使得硝化系统与反硝化系统合二为一,比如,同步硝化反硝化(SND)和同步亚硝化-厌氧氨氧化-反硝化(SNAD)等,即C、N共存于同一系统中.因此,探讨有机碳源对短程硝化系统中微生物群落结构的影响有很大的现实意义.本研究考察了有机碳源的存在对短程硝化系统中微生物群落结构的影响,并着重考察了有机碳源对常见自养硝化菌群的影响,以期为SND、SNAD等C、N共存一个系统的新工艺提供微生物基础,利于污染去除效果的提高.本实验采用两个SBR反应器,接种相同的活性污泥,进水分别为模拟无机城市生活污水和模拟实际城市生活污水,通过控制溶解氧(DO)和曝气时间,实现稳定的短程硝化.采用构建克隆文库的方法,对两种短程硝化系统中的微生物群落结构进行对比分析,考察有机碳源对基于城市生活污水短程硝化系统中微生物群落结构的影响,确定优势菌群,以期为实现可控短程硝化提供微生物群落调控方面的理论依据.1材料与方法1.1样品采集实验采用两个构造相同由有机玻璃制成的SBR反应器,内部设置定时搅拌装置和精确曝气装置.反应器1的进水采用模拟无机城市生活污水,反应器2的进水为模拟实际城市生活污水,两个反应器中的具体水质指标(mg/L)为:COD(CH3COONa)200(只有反应器2中添加),NH4+-N(NH4Cl)70,碱度(CaCO3计)500,磷(KH2PO4)2;铁(FeSO4⋅7H2O)1,硼(H3BO3)0.2,锰(MnCl2⋅4H2O)0.2,锌(ZnSO4⋅7H2O)0.2,铜(CuSO4⋅5H2O)0.1,镁(MgSO4⋅7H2O)0.1,镍(NiCl2⋅6H2O)0.2,钴(CoCl2⋅6H2O)0.3.两个反应器内的接种污泥均取自北京某污水处理厂曝气池,其硝化性能良好,f值在0.7左右,污泥指数(SVI)值在90mL/g左右,污泥浓度(MLSS)在3500mg/L左右.实验过程中控制温度在20~22℃,pH值在7.2~7.9,溶解氧在0.5~1mg/L,经过80个周期的运行,两个反应器内的NO2--N积累率均达到90%以上,继续运行30个周期,NO2--N积累率维持稳定,成功实现了短程硝化的稳定运行.在两反应器的稳定运行时期(第110个周期),进行污泥样品采集,对应编号样品为R1和R2,样品采集后在-20℃下保存.1.2实验方法1.2.1细菌总DNA提取泥样在1.5mL离心管中静沉30min后去除上清液,15000r/min高速离心5min后,去除上层清液,取0.3g泥样用于总DNA提取,剩余污泥冷冻备用.采用上海生工提供的“Ezup柱式基因组DNA抽提试剂盒(土壤)”提取后,取5μL用1.2%琼脂糖凝胶检测.其余置于-20℃储存备用.1.2.2聚合酶链式反应(PCR)将提取的细菌总DNA作为PCR的模板,采用针对细菌16SrRNA基因的通用引物对27f(5′-AGAGTTTGATCCT-GGCTCAG-3′)和1492r(5′-TACGGYTACCTTG-TTACGACTT-3′)进行PCR扩增.PCR反应体系(50μL):10×PCRBuffer5μL,dNTP(各2.5mmol/L)1μL,27f(20μmol/L)1μL,1492r(20μmol/L)1μL,TaqDNA聚合酶(5U)0.5μL,DNA模板0.5μL,加ddH2O至50μL.PCR采用降落式扩增程序,具体反应条件为:首先95℃预变性1.5min;其次95℃变性0.5min,60℃退火0.5min,72℃延伸2min,5个430中国环境科学36卷循环;之后95℃变性0.5min,55℃退火0.5min,72℃延伸2min,5个循环;之后95℃变性0.5min,50℃退火0.5min,72℃延伸2min,15个循环;最后60℃延伸10min.将提取的细菌总DNA作为PCR的模板,采用针对AOB功能基因amoA的引物对amoA-1F(5′-GGGGTTTCTACTGGTGGT-3′)和amoA-2R(5′-CCCCTCKGSAAAGCCTTCTTC-3′)进行PCR扩增.PCR反应体系(50μL)为:10×PCRbuffer5μL,dNTP(各2.5mmol/L)2μL,amoA-1F(20μmol/L)1μL,amoA-2R(20μmol/L)1μL,TaqDNA聚合酶(5U)0.5μL,DNA模板2μL,加ddH2O至50μL.PCR反应条件为:首先94℃预变性5min;其次94℃变性30S,55℃退火