第20卷第2期石油化工高等学校学报Vol.20No.22007年6月JOURNALOFPETROCHEMICALUNIVERSITIESJun.2007文章编号:1006-396X(2007)02-0001-04外源微生物强化修复石油污染土壤的研究魏小芳,张忠智*,郭绍辉,冀得坤,罗一菁,苏幼明(中国石油大学(北京)化学科学与工程学院,北京102249)摘要:通过对大港油田石油污染土壤进行异位强化生物修复,考察投加外源微生物是否能够加速生物修复进程以及土壤中石油污染物质降解的影响因素。收集的土壤分为两组后充分混合,干土中含油质量分数分别为8416,16385mg/kg。通过监测降解过程土壤中油含量的变化,分别考察自然菌群、营养刺激自然菌群、不同外源微生物、疏松剂(锯末)、不同初始油含量等因素对石油污染物降解的影响。色谱-质谱分析手段分析降解前后石油污染物质组分的变化。石油污染土壤经过300d的处理,在水含量一定的前提下,外源微生物对于石油污染物质加速降解具有显著作用。疏松剂和外源微生物协同作用下除油效果显著,除油率高达79%。降解前后的石油物质色谱-质谱分析表明,相对分子质量小于C28的烷烃的微生物利用率高于相对分子质量大的烷烃,微生物可以有效降解多环芳烃。关键词:石油污染土壤;本源微生物;外源微生物;生物修复;总石油烃含量中图分类号:X740文献标识码:AExSite-BioremediationofPetroleum-ContaminatedSoilWithExogenousMicrobeWEIXiao-fang,ZHANGZhong-zhi﹡,GUOShao-hui,JIDe-kun,LUOYi-jing,SUYou-ming(Chemistryscienceandengineeringfaculty,ChinaUniversityofPetroleum,Beijing102249,P.R.China)Received14November2006;revised29January2007;accepted21March2007Abstract:Experimentwasundertakenforexsite-bioremediationofoil-contaminatedsoilwhichcomesfromDagangoilfield,whethertheexogenousmicrobesacceleratetherateofthebioremediationornotisstudiedandtheimpactfactorsonthebiodegradationofthepetroleum-contaminatedsoilwereinvestigatedtoo.Thecollectedsoilweredividedintotwogroupsthenmixed,andthetotalpetroleumhydrocarbon(TPH)was8416,16385mg/kgrespectively.TheTPHofthesoilwasmonitoredduringthetreatmentandtheinfluencefactorssuchasindigenousconsortium,bio-stimulating,differentexogenousmicrobe,bulkagent(sawdust),thevariedinitialTPHofthesoilwereinvestigated.Thecomponentschangesofthebio-treatedoilandtheuntreatedoilwereanalyzedbyGC-MS.Theexperimentwaslastedfor300d.Whenthewatercontentofthesoilisgiven,theexogenousmicroorganismcanspeedupthebiodegradationofthepetroleumgreatly,andthereductionratioofTPHreachedto79%withthecombinationoftheexogenousmicrobeandbulkagent.TheresultsofGC-MSshowthatthealkanecanbebettermetabolizedbymicroorganismswhentheirmolecularweightarelessthanC28andthemicrobescanbiodegradatethepolycyclicaromatichydrocarbonefficiently.Keywords:Petroleum-contaminatedsoil;Indigenous;Exogenousmicrobe;Bioremediation;Totalpetroleumhydrocarbons(TPH)*Correspondingauthor.Tel.:+86-10-89734284;fax:+86-10-49744636;e-mail:zzzhang@cup.edu.cn在原油的开采、加工、运输过程中产生的石油污染威胁着人类的健康。生物方法修复石油污染费用收稿日期:2006-11-14作者简介:魏小芳(1970-),女,河北保定市,在读博士。基金项目:国家自然科学基金(No.40472152)。*通讯联系人。低、环保、公众接受程度高,具有良好前景和巨大发展潜力。土壤作为环境中最大的受体,具有一定程度的自净能力,但是土壤颗粒与石油污染物质一旦结合,难于实现油、土分离,导致土壤中的石油污染物质的生物可利用性低[1-2],使得土壤中的石油污染物质的降解速度减缓。微生物作用下加速油土剥离,提高污染物质的生物可利用性成为一个新思路。本研究是对大港油田的石油污染土壤异位微生物强化修复,通过接种优势菌和代谢表面活性剂的微生物、补充无机营养物、添加疏松剂,强化石油污染土壤的生物修复进程。分析影响微生物强化修复的主要物理因素、优化修复条件,对降解前后的石油污染物质进行色谱-质谱分析,探索微生物降解石油污染物质的机理。1实验部分1.1菌种来源外源微生物来源:实验室筛选到的具有降解石油污染物质能力的优良菌株B-4-9,产表面活性剂微生物W分别来源于渤海油田、河南油田采油三厂。经过鉴定均为芽孢杆菌。1.2性能评价1.2.1B-4-9降解能力的室内评价微生物B-4-9活化后,接种到液体培养基中(石油为碳源,其它组分同无机培养基),30℃,140r/min摇床培养8d,CCl4萃取水中油份,经适当稀释后测定油含量[3],同时作空白对照。1.2.2W代谢表面活性剂性能评价排油圈直径为初筛代谢表面活性剂微生物的依据。通过乳化体积和降粘率两个指标来评价生物表面活性剂性能。乳化实验:取菌液上清液5mL和2mL煤油混合预热到65℃,超声波破碎器于80W功率条件下乳化40s,25℃静置100h。取乳化层显微镜下观察。W菌降粘实验:高矿化度水(矿化度≥20000)、自来水分别加入葡萄糖(质量分数0.2%)。灭菌后分装95mL,加入80g原油,接种菌液5mL,40℃,140r/min摇床培养,24h后升温到45℃,继续培养84h,脱水后测定处理前后的石油粘度的变化。同时作空白对照。1.3土壤的预处理收集某油田被石油污染的土壤。土壤含油质量分数分布从3354mg/kg到136904mg/kg不等。土壤经5mm的筛过筛,混合均匀后测定油含量。同时测定土壤的氮、磷、有机质、水分质量分数(土壤按烘干土记),结果见表1。预处理后的土壤分为两组,干土中含油质量分数分别为8416,16385mg/kg。比较添加蓬松剂(锯末,添加量15%(体积分数))、外源微生物、营养、水分的强化修复效果,实验方案见表2。土壤中有机质、氮、磷比例严重失调。任磊[4]统计m(C)/m(N)/m(P)为25∶1∶0.5,据此添加P源为K2HPO4-KH2PO4的缓冲溶液,pH=7.0,N源为NH4-N和NO3-N,其质量分数分别为52%,48%。1.4生物修复石油污染土壤实验实验木箱规格为:45cm×30cm×26cm。B-4-9、W菌活化两次后(菌浓度≥108),含油土壤中投加菌液,经常翻动土壤,保持水分,检测菌落总数和土壤N,P含量。实验持续了300d,降解前后的油用色谱-质谱方法进行分析,探索微生物降解的机理。表1石油污染土壤理化指标Table1Parametersoftheoil-contaminatedsoil土样w(水分),%w(可溶盐分),%w(有机质),%w(土壤全磷),%w(土壤全氮),%pH132.536.50.0120.0028.10232.609.00.0100.0068.15表2石油污染土壤生物强化修复实验设计Table2Treatmentcombinationoftheoil-contaminatedsoil编号实验设计w(初始油)/(mg·kg-1)w(水分),%1+营养+水分8416132+营养+水分+锯末8416133+营养+水分+锯末+外源菌W8416134+营养+水分+锯末+外源菌B-4-98416135+营养+水分+锯末+外源菌W16385136+营养+水分+锯末+外源菌B-4-916385132石油化工高等学校学报第20卷1.5分析方法土壤中油含量测定方法为红外分光光度法,重量法测定土壤水分含量、可溶性盐分含量。土壤中有机质的测定方法:GB9834-88;土壤全磷测定方法:GB9837-1988;土壤全氮测定方法半微量开氏法:GB7173-1987;土壤中pH的测定:玻璃电极法,水土体积比为2.5∶1。色谱-质谱条件:HP-5MS石英毛细管色谱柱(30m×0.25mm×0.25μm);恒温不分流进样,进样口温度290℃;升温程序:柱温80℃保持1min,3℃/min升到300℃保持15min;载气:氦气;EI源;离子温度:200℃;电子倍增器电压1500V;扫描质量范围:35~500au。2结果与讨论2.1B-4-9降解石油物质室内性能评价微生物B-4-9室内性能评价表明其适当的含盐质量分数:0~6%;温度范围:10~30℃;pH值:4.5~9.5。摇瓶条件下,当培养基中石油质量浓度为1000mg/L时除油率为74%。2.2W代谢的生物表面活性剂性能W代谢的表面活性剂乳化体积为4mL,排油圈直径为45mm,50℃粘度数据及各菌种降粘率数据见表3。高矿化度水(矿化度为20000)中的矿物质与W菌代谢的表面活性剂结合,影响了其作用于原油的有效浓度,降粘效果略差。石油成分中除含有少量挥发性物质外,大部分难溶于水,所含烃类化合物的憎水性是微生物代谢、降解的主要障碍。微生物利用烃类的途径之一是微生物代谢的物质降低水-油界面张力,使得石油类物质变为微小的油滴,扩散到细胞内或者与胞外酶接触,被微生物利用。土壤中投加产表面活性剂菌是否有利于修复效率的提高还有待于实验考察。表3微生物W降粘数据表Table3ThereductionratioofviscosityproducedbystrainW含糖高矿化度培养基A(灭菌)m(原油)/g菌种类型粘度/(mPa·s)降粘率,%含糖自来水培养基B(灭菌)m(原油)/g菌种类型粘度/(mPa·s)降粘率,%84空白695-87空白725-89W36547.4885W26064.142.3微生物强化修复石油污染土壤机理探讨表4为生物强化修复石油污染土壤结果。由表4可见,经过300d的处理,土壤中初始含油质量分数为8416mg/kg时,最高总除油率为68.0%,初始含油质量分数为16385mg/kg时,除油率可以达到79.0%。实验结果表明:土壤中油含量在一定范围内