采油废水缺氧处理体系细菌和古细菌丰度对比王振宇

应用与环境生物学报2009，15(4):519~522ChinJApplEnvironBiol=ISSN1006-687X2009-08-25DOI:10.3724/SP.J.1145.2009.00519“采油废水”又称“采出水”或“产出水”，是指从地层中随原油一起开采出来的、含有原油的废水，是石油天然气开发过程中产生的最主要的大宗废水[1,2].这部分废水不仅含有原油，而且还溶入了许多随原油在地层中生成而形成的无机盐类、腐殖酸类、不同碳链的有机酸、多环芳烃、酚类和苯类物质.废水的处理一般采用物化–生物组合的处理工艺，而废水最终达标排放的生物处理通常采用缺氧(水解酸化)串联生物接触氧化法实现[3]，这类废水由于其由来的特殊性和成分的复杂性，提示生物处理体系中微生物组成的复杂性和特异性[4]，特别是不为关注的古细菌在污水处理体系中的比例变化和可能的功能，还少见报道.荧光原位杂交技术[5]可以探知特定微生物种群在环境中的存在与丰度，即在不破坏细胞壁的基础上对细胞直接定性和定量，也可反映微生物的时空分布.由于杂交的对象可以是完整细胞，没有必要像Northern、Southern技术一样在杂交之前首先要分离核酸，省去了DNA提取、PCR扩增以及测序等步骤；同时避免了由于多步的分子操作导致的误差.由于rRNA主要存在于活细胞内，因此FISH技术可以对微生物的活细胞进行定性和定量.我们建立了缺氧的模拟生物处理体系，以华北某油田实际废水生物处理系统中排出的污泥为种污泥，在实验室开展了油田含油废水的模拟实验，在尽量保证环境因子接近现场实际情况的条件下，利用FISH跟踪了缺氧体系从启动到稳定运行期间细菌和古细菌的比例变化，初步探讨了不同微生物群落组成丰度的变化与废水特征及处理效果的关系.1材料与方法1.1实验设计和运行条件在有效处理容积为1L的有机玻璃容器中接种200mL的种污泥和800mL物化处理后的污水进行缺氧启动，恒温循环水控制水温在(45±1)℃，溶解氧(DO)控制在小于0.5mgL-1，对应氧还电位(ORP)为－150mV.进水水质常规指标如表1，经物化处理后的废水于冷库避光保存，CODCr稳定在200mgL-1左右.采取批量实验，每天停止搅拌45min进行水样的更新，定期取污泥样品进行FISH检测，同时检测污泥SV值及出水COD变化.实验装置如图1所示.采油废水缺氧处理体系细菌和古细菌丰度对比*王振宇1,2余韬2张昱2杨敏2**陈威1(1河南师范大学生命科学学院新乡453007)(2中国科学院生态环境研究中心北京100085)ComparisonofEubacteriaandArchaeaRichnessinAnoxicTreatmentSystemforOilfield-producedWastewater*WANGZhenyu1,2,YUTao2,ZHANGYu2,YANGMin2**&CHENWei1(1CollegeofLifeSciences,HenanNormalUniversity,Xinxiang453007,Henan,China)(2ResearchCenterforEco-EnvironmentalSciences,ChineseAcademyofSciences,Beijing100085,China)AbstractThesimulatedanoxicsludgesystemusedforthetreatmentofoilproductionwastewaterwassetuptostudythechangeinrichnessofeubacteriaandarchaeabyfluorescenceinsituhybridization(FISH).TheresultindicatedthatCODremovalratewasabout40%whenthesystemwasstable.Theratiosofeubacteria(EUB338)andarchaea(Arch915)toDAPIwereusedtoindicatethecommunityrichness，indicatingthatbotheubacteriaandarchaeaoccupiedhigherratiointhesystem.Andtheratioofeubacteria,about15%,wasfoundstable,whilethatofarchaeaincreasedfrom15%to21%duringthetreatmentprocess.ItsuggestedthatarchaeawouldexistinthesludgeandcontributedtoCODremoval.Fig4,Tab2,Ref14Keywordsoilfield-producedwater;archabacteria;FISH;wastewatertreatmentCLCX172:X741摘要建立缺氧的模拟生物处理体系经过物化预处理的采油废水，利用荧光原位杂交技术(FISH)跟踪了废水处理系统启动和稳定过程中真细菌和古细菌相对丰度的变化.结果表明，系统稳定后的COD去除率在40%左右.细菌和古细菌在采油废水生物处理系统中都有很高的比例，并呈现不同的变化趋势.细菌丰度在启动和稳定后维持在15%左右；而古细菌在系统稳定过程中呈现逐渐增加的趋势，比例上升到21%.表明古细菌可以在活性污泥系统中稳定存在并发挥作用，说明古细菌在特定污水处理上具有一定的研究和应用价值.图4表2参14关键词采油废水；古细菌；荧光原位杂交；污水处理CLCX172:X741收稿日期:2008-06-05接受日期:2008-10-08*国家自然科学基金优秀群体项目(No.50621804)、国家杰出青年基金项目(No.50525824)和河南省科技攻关项目(No.082102220014)资助SupportedbytheNationalNaturalScienceFoundationofChinaforCreativeResearchGroups(No.50621804),theNationalScienceFundofChinaforDistinguishedYoungScholars(No.50525824),andtheKeySci&TechPro-gramofHenan,China(No.082102220014)**通讯作者Correspondingauthor(E-mail:[e-mail])52015卷应用与环境生物学报ChinJApplEnvironBiol1.2仪器和试剂宾达1339A分子杂交仪(北京新技术应用研究所)；Axioskop2motplus显微镜及AxioCamMRM冷图像采集器(德国Zeiss公司)；FISH用多聚甲醛(PFA)溶液等均来自鼎国生物技术有限公司；寡核苷酸探针由大连宝生物有限公司合成，末端加异硫氰酸盐荧光素(Fitc)荧光标记；其它试剂为国产分析纯.1.3水质和群落丰度分析CODCr和氮磷分析方法参照《水和废水监测分析方法(第4版)》[6]，由于原水中氮磷较低，按COD去除量补充NH4+和PO4-；每日检测SV值表征反应器中生物量变化.微生物丰度采用荧光原位杂交(FISH)法，FISH操作参考文献[7]，细菌和古细菌的杂交温度分别为46℃和42℃(黑暗中进行)，杂交时间为2~3h；分别在48℃和46℃淋洗20min；总菌的染色用10mgL-1的DAPI(4,6-diamido-2-phenylindole)试剂在黑暗中染色5min；用超纯水洗去多余的DAPI染料，干燥载玻片，在样品上滴防褪色液Citifluorsolution，盖上盖玻片，将样品密封，避光等待观察.杂交所需探针及甲酰胺浓度如表2所示.2结果与讨论2.1模拟系统运行和COD处理效果模拟体系启动后，反应器内活性污泥出现小幅下降，系统稳定后，SV30保持在8%左右，说明该污泥已经适应水质，同时COD去除率也基本稳定在40%以上.不同运行时间出水COD变化及去除率如图2.由图2可知，缺氧条件下系统对进水COD有一定的去除作用，但在系统启动初期反应器出水COD不稳定，去除率较低.2wk后，在进水COD低于250mgL-1的情况下，出水为100~120mgL-1.虽然系统ORP较低，系统内电子受体数量有限，但稳定后COD去除率也在40%.本研究没有对缺氧体系的COD去除机理进行深入的研究，但推测COD的去除可能是搅拌过程中通过表面接触提供的氧气参与反应的结果.而实际运行体系一般串联好氧接触氧化实现出水达标.2.2群落微生物的FISH检测分别选择EUB338和Arch915通用探针对同一污泥样品进行细菌和古细菌的FISH杂交，同时进行DAPI染色，并在荧光显微镜下观察、计数，不同探针选用不同的激发光产生不同的颜色.FISH的结果如图3.FISH方法允许样品经过固定后直接进行杂交，相比PCR、DGGE等其它分子生物学方法简单快速，并且由于探针作用于rRNA上，得到的结果反映了活菌的数量，可以真实体现了污泥系统的活性.2.3群落微生物的丰度变化DAPI染色是用来表征微生物总量的一个有效方法，用EUB338/DAPI和Arch915/DAPI的比值(图4)可以分别表征同一样品中生物体系中细菌和古细菌在系统运行过程中的相对丰度.由图4可以看出，在系统启动阶段，缺氧体系中细菌和古细菌数量分别为15%和13%，随着系统的运行，细菌的丰度变化不大，维持在(15±2)%；而古细菌丰度出现明显上升趋势，平均在(18±3)%.4wk后，细菌和古细菌平均数量分别为15%和20%，说明缺氧环境(ORP－150mV)利于古细菌的生长.原油产自地下数千米的地壳中，处于一个高温高压低氧的环境，一般认为古细菌只存在于厌氧、高温等极端环境，在含有石油的各种不同的环境中都发现有较高比例的古细菌的存在，例如储油池、地下原油储藏和石油污染的水体[9~11].表1生物处理污水常规指标Table1Thecommonindicesforbiologicallytreatedwastewater项目Item浓度Concentration(ρ/mgL-1)溶解性总固体TDS5560±35悬浮性固体SS30±5.5石油类TP28±5.5石油烃TPH23±3.5化学需氧量COD200±25图1反应装置示意图Fig.1Schematicdiagramofthereactor表2探针及甲酰胺浓度Table2Probesandformamideconcentration探针Probe序列Sequence(5’-3’)靶位点Targetsite1)甲酰胺Formamide(%)参考文献ReferenceEUB338GCTGCCTCCCGTAGGAGT338~35520Amann,etal.,1995[8]Arch915GTGCTCCCCCGCCAATTCCT915~93420Amann,etal.,1995[8]1)对应于大肠杆菌16srDNA序列上的位点Correspondingtothenecleotidesiteof16SrDNAofE.coli图2出水COD(■)和去除率(▲)的变化Fig.2EffluentCOD(■)anditsremovalrate(▲)5214期王振宇等：采油废水缺氧处理体系细菌和古细菌丰度对比这就是缺氧状态下活性污泥系统中存在大量古细菌的原因.但是，古细菌在废水生物处理体系中到底发挥了什么作用还不是十分清楚.相对于细菌，有关古细菌在环境中分布和功能的研究非常有限，主要集中于产甲烷菌方面.本实验体系(ORP－150mV)不适合绝对厌氧的产甲烷菌的生长，也不存在产甲烷的反应.因此，古细菌在缺氧系统中发挥的应该是产甲烷以外的作用.2005年Izzo等第一次报道了纯培养古细菌Sulfolobussolfataricus在高温条件下对酚的好氧降解[12]，并对代谢途径进行了系统的研究，