草鱼不同混养模式下围隔底泥反硝化硝化和氨化速率郭永坚

中国水产科学2011年7月,18(4):857−866JournalofFisherySciencesofChina研究论文收稿日期:2010−11−08;修订日期:2011−02−18.基金项目:国家“973”课题“养殖池塘生态系统生物功能群优化与水环境调控”(2009CB118706);“泰山学者”建设工程专项经费资助项目(JS200510013);浙江省重大科技专项(2008C02009).作者简介:郭永坚(1986−),男,硕士研究生,从事养殖水环境调控方面的研究．E-mail:[e-mail]通信作者:王芳,教授.E-mail:[e-mail]:10.3724/SP.J.1118.2011.00857草鱼不同混养模式下围隔底泥反硝化、硝化和氨化速率郭永坚,王芳,董双林,高勤峰,张美昭,田相利中国海洋大学教育部海水养殖重点实验室,山东青岛266003摘要:应用乙炔抑制法测定了草鱼(Ctenopharyngodonidellus)不同混养模式围隔底泥的硝化、反硝化和氨化速率,以探究草鱼不同混养模式对池塘底泥−水界面N元素动态变化的影响，并为草鱼养殖模式的优化提供必要的参考依据。混养组合分别为一元组(草鱼)、二元组(草鱼+鲢、草鱼+凡纳滨对虾)、三元组(草鱼+鲢+凡纳滨对虾,设2种放养比例)。结果显示:1)草鱼不同混养模式中底泥的反硝化速率范围为0~734.15µmol/(m2·d),硝化速率范围为0~1209.20mmol/(m2·d),氨化速率范围为0~41.25mmol/(m2·d)。2)草鱼不同混养模式底泥的反硝化速率较高,与很多河口和湖泊数值接近;在养殖中期,底泥的硝化速率很小甚至检测不到;底泥的氨化速率呈逐月递增趋势,以三元混养组最高。3)混养组中凡纳滨对虾(Litopenaeusvannamei)的放养密度越大,草鱼的放养密度越小,反硝化作用出现得越早,但反硝化速率很难保持开始的水平;反之,反硝化作用出现得较晚,并会随着养殖周期的推移迅速升高;放养种类越单一,底泥的硝化速率越低,且鲢(Hypophthalmichthysmolitrix)放养密度越高,硝化速率越高。从养殖模式优化的角度来看,草鱼三元混养组要优于单养组和二元混养组,但三元混养组中两种放养密度各有优劣,有待进一步优化以确定最佳放养比例。关键词:草鱼混养池塘;反硝化速率;硝化速率;氨化速率中图分类号:S961文献标志码:A文章编号:1005−8737−(2011)04−0857−10反硝化作用是湖泊、河流、河口等水域中无机态氮的主要去除方式。近年来,反硝化作用的研究已引起众多学者的关注,且多数研究集中于江河口[1–2]、湖泊[3–5]和海岸带[6–8]。对于湿地[9–10]和稻田[11]等生态系统也有少量研究。而对于养殖水体,一般认为反硝化作用只占氮收支的很小部分[12–13],很少对其进行直接测定,对于混养模式下反硝化作用的研究更是知之甚少。齐振雄等[14]研究了中国明对虾(Fenneropenaeuschinensis)不同养殖模式实验围隔中底泥的反硝化速率,郑忠明等[15]研究了刺参(Apostichopusjaponicus)不同养殖模式底泥的反硝化速率,结果都发现不同养殖模式下底泥的反硝化作用差异很大。硝化作用与反硝化作用是两个密不可分的过程,通常将之列入共同研究范围。广义上讲,反硝化作用还包括硝酸盐的氨化过程。本实验采用乙炔抑制法测定了草鱼(Ctenopharyngodonidellus)不同混养模式实验围隔底泥的硝化、反硝化及氨化速率,初步了解多元混养对池塘底质的影响,以期为草鱼不同混养模式养殖结构的优化提供数据支撑。1材料与方法1.1实验池塘与放养情况实验于2009年6–10月在山东省淡水水产研究所进行。围隔建于面积0.27hm2(90m×30m),平均水深1.5m的淡水池塘中。塘内共设围隔20个,每个围隔面积为64m2(8m×8m),各设设充气858中国水产科学第18卷石4个,气石通过塑料管连接到池塘岸边一个2kW的充气泵上。实验中投喂“海大牌”草鱼膨化配合饲料。整个实验期间除根据需要补充因渗漏、蒸发及采样而丢失的水以外,一直不换水。养殖生物放养情况见表1。其中,草鱼和鲢(Hypophthalmichthysmolitrix)于2009年5月25日放入实验围隔内,凡纳滨对虾(Litopenaeusvan-namei)幼苗于2009年6月8日放入实验围隔。每个放养模式设3个重复。1.2样品的采集、测定与计算分别在2009年6–10月(每次均在当月的11日前后)采样。于不同实验围隔内采集无扰动底泥样品(采用徐继荣[16]设计的无扰动底泥采集器,采样管可在采样完成之后,卸下作为培养管使用。d=5cm,h=33cm)。用有机玻璃采水器采集底层水样。采用改进的Do-HeeKim方法[17]测定沉积物中硝化和反硝化速率。每个围隔内采集2管底泥样品(1管加乙炔,作为乙炔抑制样,另1管不加乙炔为对照样)。采集的底泥样和底层水样快速带回实验室,同时将底泥样品的高度调整至10cm。将采样管在实验室静置2h,使其充分沉降,再用虹吸法小心地将上覆水用采集的底层水(用医用纱布过滤)置换掉,培养管内的水柱约20cm。用橡胶塞(配有磁力搅拌子)密封培养管的上下管口。使用C2H2抑制法进行反硝化培养。用30mL乙炔饱和的底层水取代培养管内的底层水,以使得乙炔抑制样的水相乙炔体积分数达到10%。另外,为抑制底泥内氧化亚氮还原酶的作用,采用100µL微量注射器透过培养管壁(预先打孔并用硅胶垫填充,可反复穿刺上百次)沿底泥的垂直方向,每隔1cm注入300µL被乙炔充分饱和的底层水。培养管置于水浴培养箱(徐继荣设计)中,开始培养实验,培养4h。位于培养箱中央的磁力搅拌器带动每个培养管内的磁力搅拌子(位于底泥上方7cm处),缓慢匀速地搅动,使得培养管内DO和营养盐均匀分布。培养结束后,立即取样用于测定N2O,按照取溶解氧的方法采集培养管中的水到60mL玻璃瓶中,加入0.3mL饱和HgCl2溶液,以固定水样,小心操作避免出现气泡。剩余的水样用0.45µm滤膜过滤,保存于30mL白色聚乙烯塑料瓶中,在−20℃下冷冻保存,用于测定NO3−+NO2−含量和NH4+含量(AAⅢ型流动分析仪测定)。实验结束后,N2O水样由南京土壤所采用顶空气相色谱法测定,采用Terry等[18]提供的公式计算水中溶解的N2O的浓度,室温下Bunsen吸收系数(β)为0.567。硝化速率、反硝化速率、氨化速率计算公式如下:tAVCv∆⋅∆=式中v为硝化速率、反硝化速率或氨化速率;V为上覆水的体积(m3);A为有机玻璃管的横截面积(m2);∆t为培养时间(d)。计算硝化速率时,∆C为对照样和乙炔样中NH4+浓度的变化(mmol/L);计算反硝化速率表1不同养殖模式下养殖生物的放养密度及比例Tab.1Stockingdensityandstockingratioindifferentfarmingmodels养殖模式farmingmodel草鱼/(kg·m−2)C.idellus鲢/(kg·m−2)H.molitrix对虾/(g·m−2)L.vannamei放养比例(C∶H∶L)stockingratio(C∶H∶L)G0.1481.0∶0.0∶0.0GS0.1220.0360.8∶0.2∶0.0GL0.1261.270.8∶0.0∶0.2GSL10.1210.0090.640.8∶0.1∶0.1GSL20.0930.0471.910.6∶0.3∶0.1注:“C∶H∶L”指草鱼:鲢:对虾质量比.Note:“C∶H∶L”refertoCtenopharyngodonidellus:Hypophthalmichthysmolitrix:Litopenaeusvannameionweightbasis.第4期郭永坚等:草鱼不同混养模式下围隔底泥反硝化、硝化和氨化速率859[µmol/(m2·d)]时,为参照样和乙炔样中N2O浓度的变化(nmol/L);计算氨化速率[mmol/(m2·d)]时,∆C为未经培养样和乙炔样中NO3−浓度的变化(mmol/L)。硝化速率、反硝化速率和氨化速率如果按上述公式计算结果为负值,均视为0[17]。同时,测定各月采样时围隔底层水水质指标和底泥有机质含量。水质指标的测定方法参照《中国环境保护标准汇编水质分析方法》[19],底泥有机质含量采用德国VarioELⅢ元素分析仪测定。1.3数据分析采用SPSS13.0软件进行数据统计分析。不同养殖模式围隔中反硝化、硝化和氨化速率先做单因素方差分析(one-wayANOVA),通过Duncan比对以比较单个月份内不同养殖模式间的差异,不同小写字母表示同一月份内不同模式间存在显著差异,未标或者相同字母代表差异不显著。方差分析前先进行方差齐性检验,以P0.05作为差异显著水平。2结果与分析2.1不同养殖模式下围隔底泥的反硝化速率实验期间不同养殖模式下底泥的反硝化速率范围为0~734.15µmol/(m2·d)(图1),各组分别对整个养殖周期中的反硝化速率取平均值,其范围在13.91~147.62µmol/(m2·d)。6月份所有围隔底泥均未检测到反硝化作用。7月份除G组外,其余各组均能检测到反硝化作用。其中,GS组反硝化速率最低,仅为0.15µmol/(m2·d),而GL组则出现较高的反硝化速率,达到78.12µmol/(m2·d)。而三元混养组则介于两者之间。8月份G组仍未检测到反硝化作用,其余各组的反硝化速率在3.77~11.79µmol/(m2·d),无显著性差异,但整体水平高于7月份。GS组的反硝化速率仍最低。9月份G组出现较低的反硝化速率,为3.93µmol/(m2·d);GSL1组达到45.22µmol/(m2·d),为全组最高。10月份除GL组外,各组的反硝化速率基本都达到最高值,且G组的反硝化速率在各处理组中达到最高。图1不同养殖模式下底泥的反硝化速率G、GSL1、GSL2、GS、GL分别代表不同的养殖模式,详见表1.柱图上方不同字母表示同一个月不同组之间反硝化速率存在显著差异(P0.05).Fig.1denitrificationratesofsedimentindifferentfarmingmodelsG,GSL1,GSL2,GSandGLmeandifferentfarmingmodels,referingtotab.1fordetails.Differentlettersonthecolumnsmeansig-nificantdifferenceindenitrificationrateamonggroupsforeverymonth(P0.05).860中国水产科学第18卷2.2不同养殖模式下围隔底泥的硝化速率实验期间不同养殖模式下底泥的硝化速率范围为0~1209.20mmol/(m2·d)(图2),各组分别对整个养殖周期的硝化速率取平均值,其范围为59.67~147.62mmol/(m2·d)。6月份:GSL2组未检测到硝化作用,G、GSL1有较高的硝化速率,GS、GL的硝化速率则相对较小;7、8月份各组均未检测出硝化作用;9月份GSL1、GS和GL组开始有较小的硝化速率出现[3.21～13.03mmol/(m2·d)];10月份除G组硝化速率依旧为0以外,各组均达到几个月来的最高值,其中GSL1组达到1209.20mmol/(m2·d)。就每个处理组的逐月变化来看,G组仅6月份有较高的硝化速率,其后均检测不到硝化作用;GSL2组则直到10月份才出现较高的硝化速率。2.3不同养殖模式下围隔底泥的氨化速率实验期间不同养殖模式下底泥的氨化速率范围为0~41.25mmol/(m2·d)(图3),各组分别对整个养殖周期的氨化速率取平均值,其范围为6.20~21.88mmol/(m2·d)。6月份,GSL1组、GSL2组和GS组底泥的氨化速率均为0