搜索
中国环境科学2017,37(3)：1137~1145ChinaEnvironmentalScience常规和倒置A2/O工艺活性污泥微生物群落结构的比较李鹏1,2,毕学军3,王军2,汝少国2*(1.山东省环境保护科学研究设计院,山东济南250013；2.中国海洋大学海洋生命学院,山东青岛266003；3.青岛理工大学环境与市政工程学院,山东青岛266033)摘要：为了探究倒置A2/O工艺脱氮除磷效果优于常规A2/O工艺的机理,利用聚合酶链式反应-变形梯度凝胶电泳(PCR-DGGE)技术与纯培养方法分析了2种工艺活性污泥中微生物群落结构.结果显示,2种工艺活性污泥的优势菌群均含有β-变形菌与γ-变形菌;倒置A2/O工艺活性污泥中检测到大量的亚硝化螺旋菌、红环菌和4种未培养的拟杆菌,而这些菌类在常规A2/O工艺中含量较少;利用纯培养方法在倒置A2/O工艺活性污泥检测到的γ-变形菌纲希瓦氏菌属、克雷伯氏菌属和类球红细菌在常规A2/O工艺样品中未检测到.推测以上菌种的存在可能是倒置A2/O工艺具有较高脱氮除磷效果的主要原因.此外,扫描电镜结果显示倒置A2/O工艺活性污泥较为疏松,丝状细菌含量较少,且不存在念珠状细菌.关键词：活性污泥；微生物群落结构；PCR-DGGE；倒置A2/O中图分类号：X172文献标识码：A文章编号：1000-6923(2017)03-1137-09MicrobialdiversityinactivatedsludgesofconventionalandreversedA2/Oprocesses.LIPeng1,2,BIXue-jun3,WANGJun2,RUShao-guo2*(1.ShandongAcademyofEnvironmentalScience,Jinan250013,China；2.MarineLifeScienceCollege,OceanUniversityofChina,Qingdao266003,China；3.SchoolofEnvironmentalandMunicipalEngineering,QingdaoTechnologicalUniversity,Qingdao266033,China).ChinaEnvironmentalScience,2017,37(3)：1137~1145Abstract：Toexplorethereasonwhyremovalefficiencyofnitrogenandphosphorusinreversedanoxic-anaerobic-oxic(A2/O)processishigherthanthatinconventionalA2/Oprocess,bacterialcommunitycompositionsofactivatedsludgesfromthetwoprocedureswereinvestigatedbyPCR-DGGE(polymerasechainreaction-denaturinggradientgelelectrophoresis)techniqueandcultivationmethod.BetaproteobacteriaandGammaproteobacteriaweredetectedasdominantbacteriainactivatedsludgefrombothprocesses.IntheactivatedsludgeofthereversedA2/Oprocess,alargeamountofNitrosospirasp.,Rhodocyclussp.,andfourunculturedbacteroidetesbacteriumweredetectedbyPCR-DGGEtechnique,whilelessofthesebacteriawerefoundintheconventionalA2/Oprocess.Shewanellaalgaesp.,Klebsiellasp.,andRhodobactersphaeroidesofGammaproteobacteriawereseparatedfromtheactivatedsludgeofreversedA2/Oprocessbycultivationmethod,whiletheywereabsentfromtheconventionalA2/Oprocess.Thediversityoftheseabove-mentionedbacteriaspeciescouldaccountforthehigherremovalefficiencyofnitrogenandphosphorusinthereversedA2/Oprocess.Additionally,scanningelectronmicroscopyshowedthattheactivatedsludgeofreversedA2/Oprocesswasrelativelyloose,withlessFilamentousbacteriaandnoNostoc.Keywords：activatedsludge；microbialcommunitystructure；PCR-DGGE；reversedA2/Oprocess目前,我国80%以上的城市污水处理厂采用活性污泥法降解有机污染物,降解效率主要取决于活性污泥中微生物的结构与功能[1–2].传统污水处理厂多采用A2/O(厌氧-缺氧-好氧)工艺,该工艺兼顾脱氮和除磷双重功能,由于2种功能对动力条件的要求不一致,导致除磷效果不尽理想[3].为进一步强化除磷效果,研究者设计了倒置A2/O(缺氧-厌氧-好氧)工艺,以期解决常规A2/O工艺存在的问题[4].研究表明,倒置A2/O工艺对有机污染物、氨氮与磷酸盐的去除效率明显优于常规A2/O工艺[5],但是2种工艺的微生物结构和功能存在哪些差异,从而导致脱氮、除磷效果不一致尚不清楚.因此,本研究从常规A2/O与倒置A2/O工艺的好氧区末端采集活性污泥样品,利用收稿日期：2016–07–22基金项目：山东省自然科学基金重点项目(ZR2014DZ001);高等学校博士学科点专项科研基金资助课题(20120132110011)*责任作者,教授,rusg@ouc.edu.cn1138中国环境科学37卷聚合酶链式反应-变性梯度凝胶电泳(PCR-DGGE)技术鉴定了2种工艺活性污泥中微生物群落结构,同时采用显微镜观察和分离培养技术得到单一菌株,并对可培养菌株进行鉴定,以探究倒置A2/O工艺脱氮除磷效果优于常规A2/O工艺的机理.1材料与方法1.1材料将青岛市团岛污水处理厂(以处理城市生活污水为主)曝气沉砂池出水引入A2/O与倒置A2/O工艺的小试试验装置(图1).2种工艺的有效容积均为289L,进水量400mL/min,水力停留时间为12h,溶解氧为2.0~3.0mg/L,泥龄为16d.每天下午采集进水与出水水样,参照《污水综合排放标准》(GB18918-2002)测定水样中的氮、磷含量.运行30d后,于好氧池末端采集活性污泥样品,取样时间为下午第2次排泥之前.图1常规A2/O和倒置A2/O工艺试验装置Fig.1Lab-scaletestingunitsofconventionalA2/OandreversedA2/Oprocesses1.216SrDNAV3区的PCR-DGGE分析1.2.1DNA的提取与纯化活性污泥中微生物基因组DNA提取采用SDS细胞裂解法[6].首先,向活性污泥中加入270µL含有50µg蛋白酶K的DNA提取液,于37℃、225r/min震荡30min;随后,加入30µL20%的SDS,65℃水浴2h,每隔20min轻轻摇动1次;6000r/min离心10min,取上清液;向沉淀中加入90µLDNA提取液,20µL10%SDS,65℃水浴10min,6000r/min离心10min.将2次获得的上清合并后,利用DNA胶回收试剂盒对粗提液DNA进行纯化.1.2.216SrDNA的扩增参照Bosshard等[7]的方法,以纯化的总DNA为模板,利用细菌16SrDNA的通用引物27F(5’-AGAGTTTGATCCT-GGCTCAG-3’)和1492R(5’-GGTTACCTTGTT-ACGACTT-3’),采用PCR方法扩增出微生物的16SrDNA.PCR反应条件参照杨倩等[8]报道的方法,扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测.1.2.3变性梯度凝胶电泳(DGGE)采用Dcode通用突变检测系统对PCR反应产物进行分离,聚丙烯酰胺凝胶浓度为8%,变性胶梯度从30%到60%(100%变性剂含7mol/L尿素和40%去离子甲酰胺).PCR样品上样量为20μL,60℃、150V电泳4h,经SYBR-GreenI染色后,利用DOC1000凝胶成像系统拍照.1.2.4DGGE条带的切割和DNA回收从DGGE胶上切下目标条带,经无菌双蒸水浸洗3次后,破碎凝胶,加入30µLTE缓冲液(pH7.6),于50℃水浴中融化,6000r/min离心5min,取上清.以回收的DNA为模板,利用大多数细菌16SrDNA基因V3区具有的特异性引物341f和518r进行PCR扩增.1.2.516SrDNA基因V3区的克隆、测序与分析PCR产物切胶后,利用DNA胶回收试剂盒对16SrDNA进行回收纯化.将纯化的PCR产物与pGM-T载体连接后,转化到感受态细胞,涂布于加入IPTG和X-gal的LB固体培养基.随机挑选白色菌落,置于5mLLB液体培养基(含100μL相应抗生素)中,37℃培养过夜,提取质粒,将含有目的基因的菌株送生工生物工程(上海)有限公司测序.利用BLAST软件分析16SrDNA基因序列与GenBank中收录的16SrDNA序列的同源性,用Mega5.0软件对扩增的细菌进行聚类,采用邻位相连法(Neighbor-joining)构建系统发生树,并通过自举分析(bootstrap)进行置信度检测,自举数据集为1000次[9].3期李鹏等：常规和倒置A2/O工艺活性污泥微生物群落结构的比较11391.3微生物的形态观察将活性污泥菌胶团悬液涂布于干净的载玻片上,自然干燥后在光学显微镜下镜检,选出菌体较密且分散度较好的样品.将样品置于2%戊二醛磷酸缓冲液(pH7.2)中,4℃固定过夜;次日,用40%、70%、90%和100%的乙醇依次脱水,并用醋酸戊脂置换乙醇;将上述制备好的样品置于临界点干燥器中,浸泡于液态二氧化碳中,加热至临界点温度(31.4℃,7.28MPa)以上,使之气化干燥;在真空镀膜机内把金喷镀到样品表面后,利用扫描电镜观察.1.4活性污泥微生物的纯化与鉴定1.4.1微生物的纯化将10mL活性污泥放入含有3g玻璃珠(直径0.11~0.12mm)的50mL离心管中,旋涡混合器击打15min去絮凝.自然沉降1h,收集上清液,用灭菌蒸馏水将上清液稀释102~107倍后,吸取0.1mL均匀涂布于普通肉汤固体培养基,倒置于37℃恒温培养箱中培养至形成单菌落.挑取单菌落进行划线分离纯化,将分离纯化的单菌落接种到斜面培养基上,37℃培养至菌落形成.1.4.2微生物的鉴定16SrDNA基因序列测定和分析:利用酚氯仿抽提法提取菌株的基因组DNA,利用1.3的方法扩增16SrDNA基因.利用DNA胶回收试剂盒回收PCR产物,为了剔除可能相同的菌株,选用内切酶RsaI和HhaI对所有菌株的PCR纯化产物进行酶切,并利用2%琼脂糖凝胶对酶切结果进行检测.将酶切带谱差异较大菌株的PCR产物进行纯化回收后,送生工生物工程(上海)有限公司进行测序.所得的16SrDNA序列用BLAST软件与GenBank中已知的序列进行同源性比较,确定种属.细菌的BIOLOG鉴定:选取酶切带谱差异较大的菌株在BIOLOG专用培养基上连续转接2~3次,划线接种到培养基上,37℃培养24h.用无菌棉签蘸生理盐水湿润后轻轻擦下培养基上的菌落