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第33卷第8期2007年8月北京工业大学学报JOURNAIJOFBEIJINGUNIVERSITYOFTECHNOL(X3YVol.33No.8Aug.2007城市污水SBR法短程生物脱氮系统石肖化菌群的定量分析杨庆’,彭永臻`,曾薇`,杨岸明’,HioryasusatohZ,TakashiMinoZ(1.北京工业大学北京市水质科学与水环境恢复工程重点试验室.北京100022;2.InstituteofEnviornmentalStudies,UnivesrityofoTkyo,Tok卯113一8656,Japan)摘要:为了研究实时控制对短程生物脱氮中试系统内硝化菌群结构组成的影响,在考察系统常温条件下处理城市污水时短程硝化效果的同时,采用FISH、PCR一以)裕E和CPR一克隆序列(lConigneSquenicgn)分子生物学方法对BSR中试系统(有效容积为54m3)硝化菌群中的氨氧化菌(AO)B和亚硝酸氧化菌(NO)B进行定性与定量化分析.FISH结果表明,在短程脱氮系统中,AOB相比于NOB已成为明显的优势菌群,占总菌群的3%一12%;且没有检测出NOB.PCR~DGGE结果表明,BSR短程脱氮中试系统中的A()B均以Nit~mf)nas一like为主.污泥样品的CPR一lCoinng一S沟uencing结果表明,所有的克隆相似于Nit~mona:,其中60%以上的克隆相似于Nitor-犯mona￡翻阳加即.关扭词:BSR;短程生物脱氮;iFhs;PCR~IXX二E;CPR一克隆序列中图分类号:X703一文献标识码:A文章编号:0254一0037(2007)05一0843一06近年来由于氮磷的过量排放,受纳水体的富营养化现象日益严重,而我国城市污水处理厂的N、P去除率普遍不高,尤其是低C/N城市污水的脱氮问题已成为当今城市污水处理厂巫待解决的主要难题.短程生物脱氮工艺由于具有节约能耗、节省碳源等优点,在一定程度上是解决低C/N废水脱氮问题的好方法,因此已成为国内外污水处理的研究热点〔’].目前的研究多是集中在对短程生物脱氮影响因素的研究,较少涉及以优化工艺为目的的硝化菌群内部结构分析,缺少对“微生物”在不同状态下动态变化的调控研究与分析胳3〕.近年来快速发展的以分子生物学手段为活性污泥的种群分析提供了新的拓展空间,以聚合酶链式反应(因lymerase。hainreaetion,简称PeR)和荧光原位杂交(fluoreseeneeinsituhybridization,简称lFsH)为代表的分子生物学分析方法应用于污水生物处理系统硝化菌41[的原位检测已有文献资料报道.为了充分了解氨氧化菌(ammonia一oxidizingbaeteria,简称A()B)和亚硝酸盐氧化菌(nitrite一oxidizingbaete-ira,简称NOB)两大菌群在实时控制模式下的结构分布及生物活性的动态变化,有必要在对短程脱氮系统特性研究的基础上,进一步研究硝化菌群的结构组成及空间分布.1试验材料和方法1.1试验设备与运行方案试验用水采用北京某城市污水厂初沉池出水,活性污泥的种泥取自该污水厂的回流污泥,原水水质情况如表1所示.试验的中试反应器建于该污水处理厂初沉池附近,SBR反应器池体由钢板焊制,内部做防腐处理,反应器的有效容积为54m3,装置如图1所示.在试验过程中,为节省外碳源的投量,均采用多段进水的运行方式,进水泵设置在初沉池的出水检查井中,进水量既可通过浮球液位计来控制,也可通过时间控制.当进水量满足要求后,停止进水泵,启动鼓风机进行曝气,恒定曝气量为1.44m3/min;硝化反结收稿日期:2006一12一05.基金项目:国家`.八六三”重大科技专项资助项目(2004AA601020);国家自然科学基金重大国际合作项目(5()5l214()()75卜“十一五”国家科技支撑计划(Zoo6BAC19B03);国家自然科学基金资助项目(50608()()l).作者简介:杨庆(1979一),男,黑龙江哈尔滨人,博士生.北京工业大学学报2007年束后,鼓风机停止曝气.第2次进水并启动潜水搅拌器利用原水中有机物进行缺氧反硝化,反硝化反应结束后,停止搅拌、继续曝气.重复进行好氧/缺氧交替的进程,直至反应器加满水,最后一次反硝化过程启动碳源投加泵为系统补充碳源.整个反应过程按照实时控制策略操作运行.反应全部完成后按照设定的时间进行沉淀,之后通过潍水器排水,排水完成后进入闲置阶段等待进入下一个周期.系统的平均污泥浓度控制在2500mg/L左右,污泥龄为12一巧d.农1试验用水水质情况介b一eIT触e七aacretrorex卿imenta一waset附aetrmg·L一lP,〕】〕120一210p呵一N40一80p呵一N0一0.9p呵一N0一0.345一1001.2试验分析方法试验过程每105读取1次在线参数,包括pH值、户二、氧化还原电位(oxidationreduetion闪tential,简称ORP),并根据其变化规律间隔30一60min取水样·根据标准方法测定水样中的p~,p呵一N,。N-Os一N,。-Noz一N,。,;pH值,;oo和oRP的检测采用德国WwT公司的IQsensornetsystemls4系列在线仪表及传感器测定.1)IFSH及寡核昔酸探针按照Amann的操作方法进行lFsH分析〔5〕.采用质量分数为4%的多聚甲醛溶液,在4℃下对污泥样品固定2一3h.对固定后的污泥样品进行超声分散1min,然后将样品滴加在明胶包被过的载玻片上,在空气中干燥后,将其先后浸泡于体积分数为50%,80%和98%的乙醇溶液中脱水各3min.杂交缓冲液包括0.gmol/LNaCI、20mmol/LTris/HCI,质量分数为0.01%的+二烷基硫酸钠(刘iumdodeeylsulfate,简称SDs)和甲酞胺(质量分数见表2),pH值为7.2.将荧光标记的寡核昔酸探针溶解于杂交缓冲液中,在46℃下与污泥样品杂交2h.采用的寡核昔酸探针列于表2.杂交结束后,采用洗脱缓冲液在48℃下洗脱20min.在干燥后的样品上滴加抗荧光衰减液,采用OLYMPUSBX52型荧光显微镜对每个污泥样品随机拍摄20一25张照片,并用于LiecaQwIN软件进行定量分析.2)PeR一变性梯度凝胶电泳(denaturinggradientgeleleetorphoresis,简称DGGE)采用FastnNAspinfor5011试剂盒进行污泥样品的DNA提取.PCR引物采用AmoA一IF一Clamp(其基因序列为5几Clamp~GGGGTTTCTACTGGTGGT一3`)和AmOA一ZR一TC(其基因序列为5气CCCCTCTGCAAAcGcTTcTTG3’),特异性扩增AOB.PcR混合液(50拜)L包括:35.5拌L超纯水;5川JPcR缓冲液;1拌L正向引物(50pmol/拌L);l拌L反向引物(50pmol/产I矛);0.5拌IJsuTaqDNA聚合酶;5拌LdNTP(1.25第8期杨庆等:城市污水BSR法短程生物脱氮系统硝化菌群的定量分析mmol·L一’);2拜IJDNA模板.PeR反应条件:95℃下10min,35个循环(94℃下一5、,55℃下205,72℃下Zmin),最后72℃下延伸smin.表2iFhs分析中采用的寡核普酸探针aTble2165rRNA·ta邝etedoligonucleotidePorlx绍used探针w甲院胺/%荧光标记物检测目标EUBmix,FITC几乎全部EubaeteriaN段)122535C归Ammonia一oxidizing卜PortoebaeteriaNIT340C邓NitorbaeteriaNtsPa66235Cy3NitosrPiar,EuBmix由EuB33:8EUB338ll:EuB338m二1:1:1混合组成,其甲酞胺浓度不受限制,可遵循与其混合的另一种目标探针的甲酞胺浓度.采用美国草。Rad公司的DcodeSystem检测系统对AmoAPCR产物进行I〕GGE分析.分别准备2种质量分数为30%和70%的凝胶溶液变性剂,在100v、60℃、1火TAE缓冲液中运行15h.vistraGreen染色凝胶20min,然后在Fluorlmage595成像系统中进行观察.3)PCR一克隆序列(Cloni飞sequeneing)分析PCR引物采用标准的AmoA一IF(基因序列为5`-GGGGTTTCTACTGGTGGT一3’)和AmoA一ZR(基因序列为5`~CCCCTCKGsAAAGCcTTcTTG3’),特异性扩增AOB.PcR混合液(50拌L)包括:35.5拌L超纯水;5拌LpCR缓冲液;1拜L0.25拜mol/L正向引物;1拼L0.25拼mol/L反向引物;0.5拌I砂l.ZsuTaqnNA聚合酶;5拜Lo.Zmmol/LdNTPs;2拼LnNA模板.反应条件同2).PCR产物采用QIqAuiekPCRpurifieation试剂盒进行纯化后,与pnriveCloning载体连接.重组体在QIAGENPCRlConing试剂盒中导入QIAGENEz感受态细胞.将转化混合液涂布于含有氨卡青霉素的琼脂培养皿,在37℃下培养18h.通过蓝白斑筛选阳性克隆体,采用M13正向引物和反向引物直接对阳性克隆体中的AmoA基因片段进行特异性扩增,通过琼脂搪凝胶电泳检验M13PCR产物,从中选取8个阳性克隆体(ES,Eg,FS,E12,Fll,F12,Cg,8D)的M13PCR产物,采用ABI3100基因测序仪进行测序分析.应用AutoASSemble:软件对测序结果进行处理后提交到网站。.ip,采用BLASTseacrh软件进行目标序列和基因库中所含序列的相似性分析.参考BLAST分析结果,选取相关性AmOA基因序列,建立包含目标序列和相关性序列的FASTA格式的文件,提交到网站hi印://采用lCusatlW软件进行目标序列和相关性序列的对比分析并建立系统发育树.2结果与分析2.1实时控制模式下短程生物脱氮的实现与德定为了避免过度曝气,准确地把握BSR法氨氧化反应的终点,以实现短程硝化.彭永臻等选择了可在线检测、响应时间短、精度较高的ORP、p,和pH值作为被控变量进行了大量研究〔6一7〕.在此基础上,本试验采用分段进水的模式对实时控制好氧/缺氧时间条件下短程生物脱氮的实现与稳定进行了中试研究,分3次进水的SBR法交替硝化反硝化过程中p~、p呵一N、pN`一N、pN-()s一N随时间的变化规律及在线参数pH值相应的变化规律见图2.当好氧曝气过程进行到30min时,有机物基本降解完成,此时在pH曲线上会出现由上升变下降的a点,之后出现的b点、。点、d点可分别指示每阶段氨氧化反应的终点.通过对交替好氧/缺氧过程的实时控制,系统的总氮去除率达到98.2%,而且获得了较好的短程硝化效果,各段硝化反应结束时的亚硝化率均在95%以上.实时控制是短程硝化得以实现的主要因素,由于N()B必须在(A)B产生亚硝酸盐后方可生长,因此,如果在氨氮刚好氧化完成时或之前停止曝气,亚硝酸盐将有所累积,应用实时控制,既可保证氨氮被完全氧化,又防止了亚硝酸盐的进一步氧化,是短程硝化实现的必要条1匕京工业大学学报2007年件.同时交替缺氧/好氧的运行模式也加快了短程硝化实现的步伐,每个缺氧段之后的好氧段AOB总是比NOB提前恢复活性,因此(A)B在硝化菌中的比例被大大提高,并最终成为优势菌种.为了更加直观地考察中试系统内硝化菌群的结构和演替规律,进行了一系列分子生物学试验.2.2中试系统内AOB与NOB的IFSH定t分析结果SBk中试短程生物脱氮系统的IFSH定量分析结果为:AOB占总菌数的3%以上,N()B的量极少,几乎没有检出.IFSH定量结果表明,在亚硝酸盐积累率高于80%后,AOB在活性污泥中所占的比例与亚硝酸盐积累率没有明显的相关性,但AOB相比NOB已成为明显