城市污水厂MCR1基因及其携带菌的污染

中国环境科学2018,38(4)：1433~1440ChinaEnvironmentalScience城市污水厂MCR-1基因及其携带菌的污染马奔,黄雅梦,王若楠,王新宇,曹振华,张媛,张青云,徐炳乾,袁青彬*(南京工业大学环境科学与工程学院,江苏南京211816)摘要：研究了南京某城市污水处理厂MCR-1基因及其携带菌的污染特征,从MCR-1的分布特征、影响因素及MCR-1携带菌的耐药特征等方面综合评价.结果发现MCR-1随处理流程丰度下降,去除率达83.6%,但其相对丰度在出水中显著升高,剩余污泥中含有高浓度MCR-1,浓度达2.88×1012copies/L.粘菌素耐药菌同样沿处理流程逐渐降低,出水降至53CFU/mL,去除率达99.98%,但在剩余污泥中浓度高达2.04×105CFU/mL.相关性分析发现MCR-1丰度与氨氮含量呈正相关,而相对丰度与COD、总氮和硝酸盐含量呈负相关.耐药特征分析表明曝气池(CAST、MSBR)和曝气生物流化池(ABFT)中MCR-1携带菌可耐受较高浓度粘菌素,且污水处理使MCR-1携带菌对粘菌素的耐受能力提高.表明污水处理流程不但无法完全去除MCR-1及其携带菌,且导致耐药性风险提高.本研究可为评价污水中以MCR-1为代表的超级抗性基因的环境风险提供参考.关键词：MCR-1；粘菌素；污染特征；分布；耐药特征中图分类号：X172文献标识码：A文章编号：1000-6923(2018)04-1433-08ThepollutionofMCR-1andMCR-1hostingbacteriainmunicipalwastewatertreatmentplants.MABen,HUANGYa-meng,WANGRuo-nan,WANGXin-yu,CAOZhen-hua,ZHANGYuan,ZHANGQing-yun,XUBing-qian,YUANQing-bin*(CollegeofEnvironmentalScienceandEngineering,NanjingTechUniversity,Nanjing211816,China).ChinaEnvironmentalScience,2018,38(4)：1433~1440Abstract：ThestudyinvestigatedthepollutioncharacteristicsofMCR-1andMCR-1hostingbacteriainamunicipalwastewatertreatmentplantinNanjing,China.Theirdistributionandinfluencefactors,aswellasantibioticresistancecharacteristics,werecomprehensivelyassessed.TheresultsindicatedthattheMCR-1abundancedecreasedobviouslyalongwiththetreatmentprocess,withthereductionefficiencyof83.6%.However,itsrelativeabundanceincreasedsignificantlyinthetreatedeffluent.HighamountofMCR-1wasdetectedinbiosolids,withconcentrationofupto2.88×1012copies/L.Ontheotherhand,theconcentrationofcolistinresistantbacteriaalsodecreasedgraduallyalongwiththetreatmentprocess.Theirconcentrationdecreasedto53CFU/mLinthefinaleffluent,withthereductionefficiencyof99.98%,butupto2.04×105CFU/mLweredetectedinbiosolids.Accordingtothecorrelationanalysis,MCR-1abundancepositivelycorrelatedwithammoniaconcentration,whiletherelativeabundanceofMCR-1showednegativecorrelationwithCOD,TNandNO3--Nconcentration.TheantibioticresistancecharacteristicsanalysisindicatedthatMCR-1hostingbacteriaintheactivatedsludgesystem(CASTandMSBR)andaerationbiologicalfluidtank(ABFT)weretoleranttosignificantlyhighercolistinconcentrationrelativetoothersites.Additionally,thelevelofMCR-1hostingbacteriatoleranttocolistinwasenhancedbythetreatmentprocess,whichimpliedthatthewastewatertreatmentprocesscouldnotcompletelyreduceMCR-1andMCR-1hostingbacteria,andevenleadtotheincreaseoftheirpotentialrisks.ThestudywillprovideimplicationsforassessingtheenvironmentalrisksofMCR-1representedsuperantibioticresistantgenes.Keywords：MCR-1；colistin；pollution；distribution；antimicrobialresistancecharacteristic近年来,随着医疗和养殖等行业的快速发展,抗生素的滥用也愈加普遍.我国抗生素生产与使用数量均居世界前列,抗生素的滥用和污染相当严重.据统计我国抗生素人均消费达138g/a,远高收稿日期：2017-09-15基金项目：国家自然科学基金(51608260);污染控制与资源化研究国家重点实验室自主课题(PCRRF16029)*责任作者,助理教授,[e-mail]1434中国环境科学38卷于欧美发达国家,养殖业也长期存在抗生素滥用现象[1].抗生素的过量使用导致环境中细菌抗药性快速产生和发展,多种抗性基因在我国很多河流、沉积物、饮用水甚至空气中被检出[2-5].其易传播、难消除的特点可能产生严峻的生态环境风险,也成为水处理过程中新的难题.石娜等研究发现,低于1000W剂量的可见光+紫外辐照很难影响耐环丙沙星细菌的耐药性[6].城市污水处理厂广泛接纳各类废水,成为环境中抗性基因及其携带菌的重要储存库.已在我国乃至世界范围内众多污水厂检出多种抗性基因[7-8].污水处理过程难以彻底去除抗性基因及其携带菌,甚至会促进抗性基因的传播和造成细菌耐受抗生素水平的增强[8-10].2015年底,我国学者从患者和动物体内发现了耐粘菌素细菌而受到广泛关注,粘菌素被认为是对抗多重抗性细菌的“最后一道防线”.分析发现其都携带了一种新的耐粘菌素基因MCR-1.随后在抽检我国5省804头牲畜中,发现其中21%携带MCR-1[11].目前,已有超过30个国家陆续检出该基因[12-15].MCR-1基因位于质粒,可很容易地传递到其他细菌.携带MCR-1的大肠杆菌不仅对粘菌素具有抗性,通常还对多种其他抗生素表现耐药性.然而当前对于MCR-1基因的研究主要集中在动物体内和临床领域,在环境中研究非常稀少.本文以南京某城市污水处理厂为研究对象,考察了MCR-1和MCR-1携带菌的污染特征,包括分布特征及其影响因素,进而探索了MCR-1携带菌对粘菌素的耐药特征及其随污水处理流程的变化.本研究可为评价污水中超级抗性细菌及其基因的环境风险提供参考.1材料与方法1.1样品的采集和预处理图1南京市某污水厂处理工艺流程Fig.1Thetreatmentprocessofthewastewatertreatmentplant(WWTP)locatedinNanjing数字①~⑦分别代表7个取样点位:①沉砂池出水;②CAST混合液;③MSBR混合液;④曝气生物流化池(ABFT)混合液;⑤澄清池出水;⑥消毒出水;⑦剩余污泥实验所取水样来自南京市浦口区某污水厂,其日处理量为7.5×104m3,污水约80%来源于周围居民日常生活污水,另有20%来自工业园区工业污水.污水处理流程见图1,主要处理单元为两套并联运行的活性污泥法(包括CAST和MSBR),然后经曝气生物流化池(ABFT)深度处理,最终出水直接排放至长江.设7个样点位,分别为沉砂出水(INF)、CAST混合液(CAST)、MSBR混合液(MSBR)、曝气生物池混合液(ABFT)、澄清池出水(ECB)、消毒出水(EFF)和剩余污泥(BIO)(如图4期马奔等：城市污水厂MCR-1基因及其携带菌的污染14351所示).取样于2016年2~4月进行,共取样4次,从相应取样点取约1L样品至已灭菌不透光聚乙烯塑料瓶中,然后将取样瓶放置于冰盒并在2h内运送至实验室,所有样品在12h内处理和分析.1.2水质分析表1水质指标及其测定方法Table1Wastewaterqualityindexesandtheirdetectionmethods水质指标测定方法参考文献化学需氧量(COD)重铬酸盐法[16]氨氮(NH3-N)纳氏试剂分光光度法[17]总氮(TN)碱性过硫酸钾消解紫外分光光度法[18]硝酸盐氮(NO3--N)紫外分光光度法[19]亚硝酸盐氮(NO2--N)分光光度法[20]为评价常规水质指标对污水厂出水MCR-1基因丰度的影响,对样品进行常规水质指标分析.分析项目包括进水和出水样品的化学需氧量(COD)、氨氮(NH3-N)、总氮(TN)、硝酸盐氮(NO3--N)和亚硝酸盐氮(NO2--N).测定方法参见表1.1.3DNA提取和定量PCR测定抗性基因浓度样品经0.22µm微孔滤膜过滤以富集微生物,过滤后的滤膜剪成小碎片后加入DNA提取管,采用DNA提取试剂盒(FastDNASpinKitforSoil,MPBiomedicals,CA,USA)进行DNA提取,提取过程参照产品说明书.提取的DNA用琼脂糖凝胶电泳(Biolab,USA)进行鉴定,将扩增产物进行纯化并连接至质粒克隆后作为抗性基因标准品.应用LightCycler96(ROCHE)荧光定量PCR进行定量检测.MCR-1基因信息列于表2,所采用的引物已被前人文献进行了验证[8,21],同时监测样品中16S含量以获得MCR-1的相对丰度.引物由金斯瑞生物科技有限公司合成.表2MCR-1和16S基因的信息以及定量PCR操作条件Table2InformationofMCR-1and16SrDNAandtheirquantitativePCRoperatingconditions基因正向引物(5′–3′)反向引物(5′–3′)扩增长度(bp)退火温度(℃)MCR-1CGGTCAGTCCGTTTGTTCCTTGGTCGGTCTGTAGGG1205516SrDNACCTACGGGAGGCAGCAGATTACCGCGGCTGCTGG19258将含上述基因的标准质粒经10倍梯度稀释作为模板建立标准曲线.采用20µL荧光定量PCR反应体系,包括模版1µL,正向、反向引物(10µM)各0.4µL,SYBRPremixExTaqⅡ(天根生物科技公司,北京)10µL,ddH2O8.2µL.反应程序为95℃15min→(95℃10s→表2中退火温度30s,4