城市污水厂活性污泥强化自养反硝化菌研究

第+’卷第)期’(年)月环!!境!!科!!学,-./01-2,-34567/,-7,.8C+’$-8C)4DE$’(城市污水厂活性污泥强化自养反硝化菌研究常玉梅$杨琦!$郝春博$尚海涛$姜体胜’‘中国地质大学北京#水资源与环境学院$北京!(((&+’’‘北京市水文总站$北京!(((&##摘要!采集北京高碑店城市污水厂的反硝化污泥样品$以硫磺作为电子供体进行驯化培养C测定污泥的增长率来确定污泥活性$分别测定-1h+F-(61’h)浓度来确定硝酸盐的去除效率和硫酸盐生成速率C当硝酸盐去除率达到#(i以上时$提取污泥中微生物总W-4$构建%6E0-4基因片段克隆文库来分析细菌群落结构C结果表明$污泥的增长率为(‘$$UO5)@#$污泥中硝酸盐浓度与时间的关系符合一级反应C污泥中细菌类群主要为TA:HFVE8:A8QHM:AEBH(WA:HFVE8:A8QHM:AEBH(ZHGGHFVE8:A8QHM:AEBH和X9MHNNBRBA@QHM:AEBH$其中TA:HFVE8:A8QHM:AEBH类细菌占主导地位C在成熟的反硝化污泥中$自养反硝化菌J0*,+’*((41;%.*&#*X*’.1占所占比例高达)&‘%*iC此外$反应器中还存在@%.*&#’&*1,!’NDC(24#I*+’&%#NDC(J0%#!,!,.’1NDC(N%,+’&%#NDC等细菌C对自养反硝化污泥中细菌多样性的研究有利于优化反应条件$从而提高污泥的硝酸盐去除率C关键词!活性污泥’硝酸盐去除’自养反硝化细菌’克隆文库’系统发育分析中图分类号!_$’!文献标识码!4!文章编号!(’*(F++(’(#()F’(F($收稿日期#’((F(%F’&’修订日期#’((F(&F+(基金项目#国家自然科学基金项目)((’(’$$*(*$&*#’北京市自然科学基金项目&(*’($#’北京市产学研项目*#((’%*((*#’国家水体污染控制与治理科技重大专项’((#[_($’($F((&$’((#[_($)#F((’$’((#[_($’($F((#作者简介#常玉梅#&*f#$女$硕士研究生$主要研究方向为生物化学与分子生物学$,FGHB!M;H9U=?GABF*&%L%+CM8G!通讯联系人$,FGHB!=cLM?UQCA@?CM9/]$%&’6%()H4)#*M+1#)+)&+$0’75%(’)&’1’7H)’+(KH7)%&’HD0&+#90K’+H#96%()H)’+(+17)’ZH)%*4#*9%1&+6I#(’7’$H4bH,)%NH)%&24H()7\4-ZY?FGAB$Y4-ZaB$\417;?9FQ8$6\4-Z\HBF:H8$]BH9U3BFN;A9U’C6M;888RdH:AE0AN8?EMANH9@,9SBE89GA9:$7;B9HX9BSAENB:=8RZA8NMBA9MAN$TABIB9U(((&+$7;B9H’’CTABIB9U\=@E88UBM7A9:AE$TABIB9U(((&#$7;B9H#3,)&H7)!4M:BSH:A@N?@UA8RG?9BMBDHPHN:APH:AE:EAH:GA9:DH9:PHN@8GAN:BMH:A@Q=N?R?EHN:;AAAM:E89@898E?9@AEH?:8:E8D;BMC3;AN?@UAHM:BSB:=PHN@A:AEGB9A@Q=GAHN?EB9UUE8P:;EH:A8RN?@UAC3;AEAG8SHARRBMBA9M=8R9B:EH:AH9@N?RH:ADE8@?M:B89ARRBMBA9M=PAEAH9H=bA@Q=M89:B9?8?N=GAHN?EB9U:;AM89MA9:EH:B898R-1h+F-H9@61’h)Cd;A9:;AEAG8SHARRBMBA9M=8R9B:EH:APHNG8EA:;H9#(i$%6E0-4UA9A:BMBQEHEBANPAEAQ?B:?D:8M8GDHEA:;ABEGBME8QBHQB8@BSAENB:=C3;AUE8P:;EH:A8RN?@UABN(‘$$UO5)@#C3;AEAH:B89QA:PAA9M89MA9:EH:B898R9B:EH:AH9@:BGAGAA:NRBEN:8E@AEEAHM:B89JB9A:BMNC3;AQHM:AEBHB9:;AN?@UAHRRBBH:A@PB:;TA:HFVE8:A8QHM:AEBH$WA:HFVE8:A8QHM:AEBH$ZHGGHFVE8:A8QHM:AEBHH9@X9MHNNBRBA@QHM:AEBHCTA:HFVE8:A8QHM:AEBHBN:;AGHB9D;=?GB9:;AN?@UACTHM:AEBHEAH:A@:8J0*,+’*((41;%.*&#*X*’.1RE8G@A9B:EBR=B9UQB8EAHM:8EDAER8EG)&‘%*iC/9H@@B:B89$:;AQHM:AEBH8R@%.*&#’&*1,!’NDC$24#I*+’&%#NDC$J0%#!,!,.’1NDC$N%,+’&%#NDCHEAAKBN:A@B9:;AN?@UAC3;AN:?@=8RH?:8:E8D;BM@A9B:EBR=B9UQHM:AEBH@BSAENB:=BNM89@?MBSA:88D:BGBbH:B898REAHM:B89M89@B:B89NH9@ARRBMBA9:EAG8SH8R9B:EH:ACA%MN+&*,!HM:BSH:A@N?@UA’9B:EH:AEAG8SH’H?:8:E8D;BM@A9B:EBR=B9UQHM:AEBH’M89ABQEHE=’D;=8UA9A:BMH9H=NBN!!硝酸盐-1h+#是工农业和生活污水中普遍存在的污染物$对环境和人类健康都有重要影响*+C水中硝酸盐的去除为氧化还原过程$异养反硝化细菌在硝酸盐转换过程中需要有机碳作为碳源$而当污水中的有机碳源缺乏时$要完成反硝化作用就必须向污水中投放有机化合物$如甲醇或简单有机物等*’+$且投加量难以控制C针对这一问题$TBN8U9B等*++在’(世纪$(年代提出了采用自养反硝化代替传统反硝化工艺的思路C自养反硝化细菌主要有利用氢的反硝化细菌*)+和利用硫的反硝化细菌C由于很难收集氢气$所以近年来主要研究方向是利用硫的反硝化过程**+C某些硫氧化细菌可在缺氧或厌氧条件下利用还原态硫6’h(6((6’1’h+等#作为电子供体$通过氧化硫获取能量$同时以硝酸盐为电子受体$将其还原为氮气$实现自养反硝化过程*%+C以单质硫为例$其典型代谢途径如下式所示*$+!**6o’(71’o*(-1h+o+&\’1o)-\o$%%))7*\$1’-o’*-’o**61’h)o%)\oWEBNM8等*&+以硫化物和单质硫为电子供体考察了填料床层中的自养反硝化过程$结果表明以不同还原态硫为电子供体均能获得较高的反硝化率CTH:M;A8E等*$+实验研究了硫自养反硝化作为市政废水脱氮工艺的可行性$并发现在各种还原态硫中$)期常玉梅等!城市污水厂活性污泥强化自养反硝化菌研究单质硫作为电子供体时脱氮效果最佳C6BAEEHF4SHEAb等*#+曾经对饮用水处理过程中硫F反硝化作用进行了研究C刘玲花等*(+将自养反硝化细菌运用于硫与石灰石组合工艺去除地下水中硝酸盐$国内对利用还原态单质硫进行自养反硝化的研究还较少C基于%6E0-4OEW-4的现代分子生物学技术克隆文库(WZZ,(/6\等#克服了传统技术的弊端$突破了用传统的微生物分离纯化方法调查微生物多样性时$大多微生物无法得到纯培养的限制*+$能够更全面和系统地揭示各种生态环境中前所未知的微生物多样性C本研究中$反硝化污泥中添加硫磺作为电子供体$通过测定样品中-1h+(61’h)浓度来分析硝酸盐去除效率C当活性污泥去除硝酸盐效率达到#(i以上$提取微生物总W-4$构建%6E0-4基因片段克隆文库来分析细菌群落结构C对自养反硝化污泥中细菌多样性的研究有利于优化反应条件$从而高效去除硝酸盐污染COP材料与方法OQO!材料OQOQO!主要仪器马弗炉余姚远东数控仪器厂#$电热鼓风干燥箱天津市中环实验电炉有限公司#$干燥器$$’’6分光光度计$V70仪美国TB8FEH@#$V70凝胶成像仪美国TB8FEH@#$离心机$恒温水浴锅$高压灭菌锅$电泳槽北京六一厂#$超净工作台$电子天平COQOQE!主要试剂污泥培养液!^-1+%(GU$^’\V1)’GU$-H\71+(((GU$-\)7GU$2U61))$\’1GU$A61))$\’1GU$水(((G5$D\$‘(f$‘’‘63,缓冲液!G8O53EBNF\7D\&‘(#’‘*G5$(‘*G8O5,W34(‘*G5$*G8O5-H7*G5$加水至’*(G5‘琼脂糖凝胶回收试剂盒$基因全长扩增(构建克隆文库常用生化试剂COQOQR!污泥来源采集北京市某污水处理厂二次沉淀池中的反硝化污泥$污水处理采用传统活性污泥法的二级处理工艺$一级处理由曝气沉砂池和平流式沉淀池组成$二级处理由曝气池和二次沉淀池组成COQE!方法OQEQO!污泥培养将自养反硝化污泥放在*((G5培养瓶中培养$用导气管连接污泥瓶与史氏发酵管$史氏发酵管用来记录污泥的产气情况$培养瓶底层为颗粒硫磺$为污泥提供元素硫及附着点$中间层为污泥$上层为污泥培养液$放于+(r恒温培养箱中培养$培养液每天更换一次$调节污泥瓶中D\为$COQEQE!污泥增长系数的测定#将坩埚和滤纸放在(*f(r的电热鼓风干燥箱中烘干’f+;至恒重$在干燥器中冷却+(GB9$称量坩埚重P及坩埚与滤纸的重量P’C’#从污泥瓶中取一定体积)#的污泥悬浊液$过滤后将污泥及坩埚放入干燥器中烘干’f+;至恒重$干燥器中冷却+(GB9$称重P+C+#将污泥和坩埚放入马弗炉$在%((r下灼烧f’;$关闭电源$当温度降至’((r时将坩埚取出$干燥器中冷却后称重P)C)#按照下列公式计算污泥浓度!.66UO5#pP+hP’#hP)hP#)OQEQR!硝酸盐浓度测定制备硝酸盐标准曲线$参照文献*’+中的酚二磺酸光度法C从污泥瓶取样口取出一定体积上层液体$过滤C用移液管量取*(G5预处理的水样于蒸发皿中$调节至微碱性D\&#$置水浴锅上蒸发至干C加G5酚二磺酸$用玻璃棒研磨$使试剂与蒸发皿内残渣充分接触$放置片刻$再研磨一次C放置(GB9$加入约(G5水C在搅拌下加入+f)G5氨水$使溶液颜色最深C将溶液移入*(G5比色管中$稀释至标线$混匀C于波长)(9G处$选用玻璃比色皿$以水为参比$测量吸光度COQEQU!硫酸盐浓度测定硫酸盐的测定采用文献*’+中的,W34滴定法C具体操作步骤为!&取*G5水样于(G5试管中$加盐酸’滴$(i氯化钡溶液*滴摇匀$观察沉淀情况$确定水样体积为’*G5$加入钡镁混合液)G5’’取经过滤处理的水样’*G5移入’*(G5锥形瓶中$加入$*G5蒸馏水$滴加的盐酸$刚果红试纸由红色变为蓝色$放置在电炉上加热煮沸f’GB9$以除去二氧化碳C趁热加入)G5钡镁混合液$同时不断搅拌$并加热至沸C沉淀陈化过夜后滴定C加入(G5缓冲溶液$少量铬黑3指示剂$用,W34标准溶液滴定至溶液由红色变为蓝色$记录’环!!境!!科!!学+’卷,W34标准溶液的用量C取((G5蒸馏水$同法做空白校正’(测定水样的总硬度COQEQV!系统细菌多样性分析#活性污泥样品预处理当活性污泥去除硝酸盐效率达到#*i时$取污泥加入无菌离心管中$以’(((EOGB9$离心(GB9$弃上清液’加入已灭菌的生理盐水洗涤’次$再用63,缓冲液洗涤一遍’用63,缓冲液悬浮C’#基因组W-4的提取参考[;8?等*++的土壤细菌基因组提取方法C加入734T溴化十六烷基三甲胺#至终浓度为i$加入蛋白酶^至终浓度为(GUOG5$混匀$+$r水浴处理+(GB9’加入’(i的6W6至终浓度为’i$混匀$%*r水浴’;$每隔*f+(GB9轻摇一次’将裂解后的溶液’(((EOGB9离心(GB9$取上