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104|2018年2月2018年2月|105磁性HRP-CLEAs处理苯酚废水的研究唐维(天津广播电视大学，天津300191)摘要：苯酚废水对水生环境及人类健康造成危害，辣根过氧化物酶(HRP)对催化降解废水中该类污染物具有良好的效果。本文将Fe3O4纳米粒子与辣根过氧化物酶(HRP)通过混合、共沉淀、交联的方法，制备磁性辣根过氧化物酶交联酶聚集体(HRP-CLEAs)，并对磁性HRP-CLEAs的催化性能和处理苯酚废水的应用进行了探索。关键词：辣根过氧化物酶；交联酶聚集体；Fe3O4纳米粒子；苯酚0引言辣根过氧化物酶(HorseradishPeroxidase，HRP，EC.1.11.1.7)是一种工业化生产较早的植物过氧化物酶之一，在处理工业废水中含酚化合物具有效率高、反应条件温和且操作简便、受环境影响小等优点，成为过氧化物酶家族中应用最广泛的酶之一[1]。但游离酶具有操作稳定性差、储藏稳定性差、对环境敏感、酶分子易失活和难以回收利用的缺点，致使其在工业上的应用受到了限制。较游离酶而言，固定化酶具有低致敏性、高稳定性和良好的重复使用性[2]。2000年荷兰Delft大学Sheldon小组提出了用盐、有机溶剂或非离子型聚合物沉淀酶蛋白，得到酶聚集体，再用交联剂交联的无载体固定化方法—交联酶聚集体(Cross-linkedenzymeaggregates，CLEAs)技术[3]。交联酶聚集体(CLEAs)技术具有较高的催化效率、酶活回收率和重复使用率，这使得CLEAs成为工业生物催化中不可或缺的催化剂[4]。纳米级磁性材料是一种新型材料，因为材料尺寸为纳米级别，故其具有特殊的理化性质，还可通过表面修饰的方法在Fe3O4粒子表面引入各种官能团，例如氨基、羧基、醛基等。除此之外，磁性Fe3O4粒子还具有很好的生物相容性，可通过共价结合的方式与游离酶、抗体等生物活性催化物质进行结合。又因其具有磁性，可在外加磁场的作用下便捷、迅速地分离。由于Fe3O4纳米粒子具有低毒性和顺磁性，它已成功地应用于固定化酶领域，并在交联酶聚集体技术中充当重要的角色[5]。鉴于磁性Fe3O4粒子的诸多优越性能，本文将磁性Fe3O4与HRP通过共沉淀、交联的方法制备得到磁性辣根过氧化物酶交联酶聚集体(HRP-CLEAs)。制备得到的磁性交联酶聚集体可借助外部磁场从反应体系中快速简便地收集、分离，并且在去除苯酚废水的研究中，体现了不可抗拒的优越性。1实验材料与方法1.1试剂HRP(EC1.11.1.7,冻干粉,150μ/mg)于-20℃储存,上海源叶生物科技有限公司。苯酚、30%H2O2溶液等其他试剂均为分析纯。1.2实验方法(1)HRP酶活检测体系。HRP的活性采用Worthington法测定[6]。绝对酶活定义:一个过氧化物酶酶活单位相当于在规定条件下，于25℃、pH7.0，每分钟消耗1μmolH2O2所需的酶量。相对酶活R(Relativeactivity/%)：以同组实验中酶活最高点的值记为100%，相对酶活为其他实验点的酶活值与该值之比。(2)磁性HRP-CLEAs的制备。①磁性Fe3O4粒子的制备：首先将氨水加入到三口烧瓶搅拌，将FeCl3·6H2O和FeCl2溶于HCl中，再将HCl混合液倒入氨水中，常温搅拌30min；将所得粒子水洗至pH7.0，冷冻干燥。②磁性Fe3O4粒子的氨基官能团化：取0.50g磁性Fe3O4粒子加入三口烧瓶中，再一并加入2.50ml的APTES，0.63ml蒸馏水，150ml无水乙醇溶液，在30℃伴有搅拌的条件下反应10h，之后对产物进行真空冷冻干燥，得到氨基修饰的磁性Fe3O4粒子。③磁性交联酶聚集体的制备：将氨基官能团化的Fe3O4与酶液、牛血清蛋白组分五(BSAVI)混匀后，分别加入至沉淀剂饱和硫酸铵中，沉淀30min；然后将戊二醛分别加入至上述聚集体溶液中，振荡交联，用蒸馏水洗涤3次，冷藏保存。(3)磁性HRP-CLEAs去除苯酚的应用。初始反应条件拟定为：pH6.0，25℃，反应时间1.5h，分别将等酶活的磁性HRP-CLEAs和游离HRP与1mL8mMH2O2、1mL8mM苯酚反应体系混合，摇床振荡反应。苯酚浓度的测定采用4-氨基安替比林(4-AAP)比色法。2结果与讨论2.1磁性HRP-CLEAs制备的影响因素将HRP经过饱和硫酸铵沉淀后，加入至不同浓度的戊二醛交联不同的时间，得到图1。戊二醛的作用主要是提高酶活回收率，交联时间与交联浓度对酶活会产生影响，当交联时间过短或在浓度较低时，CLEAs交联不充分，稳定性差，甚至在反应过程中会向反应介质中释放酶，所以磁性HRP-CLEAs具有较低的活力；交联时间过长或者交联剂浓度过高时，酶分子发生过度交联，使得底物分子无法接近酶的活性中心，从而影响酶分子活性中心的催化作用。经实验筛选，交联剂戊二醛的最适浓度为60mM，最佳交联时间为4h。0204060801001201401600102030405060708090100Relativeactivity(%)ConcentrationofGlutaraldehyde(mM)5h4h3h2h图1交联时间与浓度对酶活的影响环保与节能106|2018年2月2018年2月|1072.2磁性HRP-CLEAs的分离磁性HRP-CLEAs具有良好的磁性，利用磁铁可将其与混合液完全分离开来。如图2所示，图a表示磁性HRP-CLEAs混合液，图b表示为分离后的磁性HRP-CLEAs。磁性Fe3O4粒子的引入打破了传统制备方法的缺点，其优点是：(1)操作简便，可在外加磁场的作用下便捷、迅速地分离，从而可以随时控制酶促反应，来提高酶的使用效率，并有利于固定化酶从反应体系中分离和回收。(2)利用外部磁场可以控制磁性固定化酶的运动方向，从而提高固定化酶的催化效率。(3)可以反复使用，从而降低操作成本。图2交联酶聚集体的分离2.3固定化酶去除苯酚条件的优化(1)酶用量对苯酚去除率的影响分别将等酶活的磁性HRP-CLEAs与游离HRP加入至苯酚、H2O2反应体系中，如图3所示，去除率随着酶的用量增加而增加，当磁性HRP-CLEAs的绝对酶活为0.5U时，去除率达到66.54%，当酶的活性超出0.5U时，苯酚的去除率增加变缓，此时酶促反应已达到平衡，酶的用量趋于饱和。因此实验选择绝对酶活0.5U为最佳反应酶量。相对而言，游离HRP反应体系中，需要更多的酶用量来使酶促反应达到平衡，这是由于游离HRP对外界环境的敏感性所致，另外H2O2与酶分子直接接触，会导致其氧化变性。0123456789100102030405060708090100110Removalefficiency(%)Enzymedosage(U)HRP-CLEAsFreeHRP图3酶用量对苯酚去除率的影响(2)pH对苯酚去除率的影响溶液pH的变化会严重干扰酶分子的微环境，从而影响酶分子与底物之间的交互作用。pH对苯酚去除率的影响，如图4所示。苯酚的去除率随pH的升高呈现先升高后降低的趋势，游离酶在酸性与碱性条件下活性明显降低。而磁性HRP-CLEAs在酸性与碱性pH环境下均能保持较高的催化能力，在pH7.0时苯酚去除率达到77.24%。这也证明了经过固定化后，共价键对酶分子具有稳定和保护作用，HRP酶分子对极端pH的抗性也因此显著提高。因此选择pH7.0为反应的最佳pH。3456789100102030405060708090100Removalefficiency(%)pHHRP-CLEAsFreeHRP图4pH对苯酚去除率的影响(3)温度对苯酚去除率的影响由图5可知，磁性HRP-CLEAs随着温度的升高，苯酚的去除率表现为上升的趋势，当温度达到30°C时去除率达到最高值82.35%。在游离酶对比实验中，苯酚的去除率随温度的升高呈先上升后下降的趋势；而使用磁性HRP-CLEAs催化时，苯酚去除率随着温度的升高没有显著变化，一直保持在70%以上，说明HRP经过交联后，具有更加稳定的结构，对外界高温环境的抗性大大提高。选择30℃作为去除苯酚的最佳温度。202530354045500102030405060708090100Removalefficiency(%)T(oC)FreeHRPHRP-CLEAs图5温度对苯酚去除率的影响(4)反应时间对苯酚去除率的影响将酶液加入反应体系中，每隔20min取出微量反应液，测定其吸光值。如图6所示，反应2.0h后游离HRP和磁性HRP-CLEAs对苯酚去除率的影响基本达到平衡。反应刚开始时，游离HRP的催化性能略高于磁性HRP-CLEAs。这是由于游离HRP完全溶解于水溶液中，和底物充分接触，而磁性HRP-CLEAs由于传质阻力的影响，酶分子与底物结合受到一定的限制。但随着时间的增加，磁性HRP-CLEAs表现出明显的优势，苯酚的最高去除率达89.04%，而游离HRP对比实验106|2018年2月2018年2月|107中，苯酚的去除率最高只有57.36%。由图可知，在相同酶活情况下，磁性HRP-CLEAs能够达到更高的催化效率，并且磁性HRP-CLEAs受H2O2浓度影响很小。因此选择反应2.0h作为去除苯酚的时间。0.00.51.01.52.02.53.03.54.04.50102030405060708090100Removalefficiency(%)Time(h)FreeHRPHRP-CLEAs图6反应时间对苯酚去除率的影响2.4磁性HRP-CLEAs去除苯酚的重复使用性对磁性HRP-CLEAs的重复使用性进行探索，并且考虑反应时间对苯酚去除率的影响。将酶液加入苯酚与H2O2混合溶液中，每次去除反应结束后将磁性HRP-CLEAs洗净，继续添加底物溶液重复利用，循环10次后，得图7。磁性HRP-CLEAs存在传质阻力，HRP与底物不能够充分地接触，反应刚开始时磁性HRP-CLEAs的催化速率略低于游离酶，但随着反应时间的增加，磁性HRP-CLEAs一组的苯酚去除率明显高于游离酶。经固定化后，磁性HRP-CLEAs的重复使用性明显增强，苯酚的去除率最高达到89.04%，经过10次的重复使用后，去除率仍保持52.37%以上。为了排除Fe3O4粒子对苯酚的吸附作用及苯酚与H2O2自发反应的干扰，实验对氨基官能团化的Fe3O4粒子去除苯酚进行了研究。实验测得，去除率由8.49%降到了5.53%，所以Fe3O4粒子对苯酚的去除率影响很小。3结语本研究采用化学交联法将HRP进行固定化，并在制备CLEAs过程中加入了氨基官能团化的磁性Fe3O4纳米粒子，制备得到磁性辣根过氧化物酶交联酶聚集体(HRP-CLEAs)，并将其应用于苯酚的去除。交联剂戊二醛的最适浓度为60mM，最佳交联时间为4h。磁性HRP-CLEAs催化降解苯酚的实验中，酶用量0.5U，反应pH7.0，反应温度30°C，反应时间2.0h，在该条件下磁性HRP-CLEAs对苯酚的催化降解能力最高。在磁性HRP-CLEAs的重复使用性研究中，苯酚的去除率最高可达89.04%，经过10次的重复使用后去除率仍保持52.37%以上。由此可得，磁性HRP-CLEAs有着良好的催化性能及重复使用性，在工业上有着更加广阔的应用前景。05101520253035400102030405060708090100Removalefficiency(%)Time(h)HRP-CLEAsFreeHRPFe3O4-NH2图7磁性HRP-CLEAs重复使用性参考文献：[1]JiangYJ,TangW,GaoJ,etal.Immobilizationofhorseradishperoxidaseinphospholipid-templatedtitaniaanditsapplicationsinphenoliccompoundsanddyeremoval[J].EnzymeandMicrobialTechnology,2014,55:1-6.[2]HanefeldU,GardossiL,MagnerE