低浓度硫丹对棕壤中主要酶活性及细菌群落结构的影响

硫丹是一种环戊二烯类广谱性有机氯杀虫剂，工业硫丹是由琢-硫丹、茁-硫丹两种异构体组成的混合物，含量比一般为7颐3，其在丙酮中的溶解度为33豫。分子结构式如下：硫丹具有触杀和胃毒作用，曾广泛用于棉花、果树、蔬菜和茶叶等作物虫害的防治。世界卫生组织（WHO）估测1984年全世界的硫丹生产量为10000t。我国从1994年开始生产和使用硫丹，多年的施用使得我国大部分地区土壤和水体中都有不同程度的硫丹残留和积累[1-4]。在环境中，硫丹具有较高的持久琢-硫丹茁-硫丹ClClClClClClOOSOClClClClClClOOSO摘要：为了解硫丹对棕壤生态系统的毒性影响，采用室内避光培养模拟实验，设定硫丹在土壤中的浓度分别为0.1、1、10mg·kg-1，取样时间为7、14、21、28d，测定土壤中脲酶、脱氢酶和茁-葡糖苷酶活性的变化，同时采用变性梯度凝胶电泳（PCR-DGGE）分子指纹技术研究硫丹在不同培养时间对土壤中细菌群落结构的影响。结果表明：土壤脲酶活性与对照相比无显著差异；脱氢酶活性受到显著抑制，且随着硫丹浓度增大，抑制作用增强；土壤茁-葡糖苷酶活性则被显著激活。经BLAST程序与GenBank数据库进行比对分析，低浓度硫丹处理在培养周期28d内，对棕壤中细菌群落结构没有产生显著的干扰作用。关键词：硫丹；土壤酶；有机氯农药；PCR-DGGE中图分类号：X172文献标志码：A文章编号：1672-2043（2014）11-2149-06doi:10.11654/jaes.2014.11.012低浓度硫丹对棕壤中主要酶活性及细菌群落结构的影响郭鹏鹏1，朱鲁生1*，王军1*，王金花1，2，王婷3（1.山东农业大学资源与环境学院，山东省高校农业环境重点实验室，山东泰安271018；2.南开大学环境污染过程与基准教育部重点实验室，天津300071；3.山东水利职业学院，山东日照276826）EffectsofLowConcentrationEndosulfanonSomeEnzymaticActivitiesandBacterialCommunityStructureinBrunisolicSoilGUOPeng-peng1,ZHULu-sheng1*,WANGJun1*,WANGJin-hua1,2,WANGTing3（1.CollegeofResourceandEnvironmental,KeyLaboratoryofAgriculturalEnvironmentinUniversitiesofShandong,ShandongAgriculturalUniversity,Tai忆an271018,China;2.KeyLaboratoryofPollttionProcessesandEnvironmentalCriteria（NankaiUniversity）,MinistryofEdu原cation,NaikaiUniversity,Tianjin300071,China;3.ShandongWaterConservancyInstituteofOccupational，Rizhao276826,China）Abstract：Alaboratoryexperimentwasperformedtoevaluatethetoxicologicaleffectsofendosulfanonsomeenzymes（urease,dehydroge原naseand茁-glucoside）andmicrobialcommunitystructurediversityinabrunisolicsoilatdifferentconcentrations（0,0.1,1mgand10mgendosulfanperkgsoil）onthe7th,14th,21stand28thdayoftreatment.Endosulfandidnotinfluencesoilureaseactivity,butsignificantlyin原hibiteddehydrogenasewithstrongersuppressionathigherconcentrations.However,theactivityof茁-glucosideenzymewassteadilyandsig原nificantlyenhancedbyendosulfan.TheDGGEdatashowedthatendosulfanat0~10mg·kg-1hadnotoxiceffectsonsoilbacterialcommunitystructureandactivities.Inconclusion,endosulfandidnotimpactbacterialcommunitystructureinthebrunisolicsoil.Keywords：endosulfan;soilenzymes;organochlorinepesticide;PCR-DGGE收稿日期：圆园14原05原07基金项目：国家自然基金（21277083,41071164,41001152，21377075）；山东省自然基金（ZR2013DQ007）；环境污染过程与基准教育部重点实验室（南开大学）开放课题基金作者简介：郭鹏鹏（1989—），女，硕士研究生，研究方向为污染修复工程*通信作者：朱鲁生E-mail：[e-mail]王军[e-mail]圆园14，33（11）:2149-21542014年11月农业环境科学学报允燥怎则灶葬造燥枣粤早则燥鄄耘灶增蚤则燥灶皂藻灶贼杂糟蚤藻灶糟藻农业环境科学学报第33卷第11期性和迁移潜力，在土壤中的半衰期一般为3~6个月。由于硫丹具有生物毒性，高浓度硫丹残留会对微生物和土壤酶活性有较强的毒害作用，抑制了土壤微生物和酶对硫丹的降解，其降解速率会随初始浓度的增加而减慢[5]。土壤生态系统的活力是农业可持续发展的首要前提，土壤质量被认为是评价环境质量、食品安全和经济活力的综合指标。因此，土壤常被作为土地可持续管理的潜在评价指标。土壤酶是土壤新陈代谢的重要因素，它与活着的微生物细胞一起推动物质转化。土壤生物化学反应几乎都是由土壤酶驱动的，在C、N、S、P等元素的生物循环中都有土壤酶的作用。土壤微生物在生态系统物质循环和能量转化中占有特别重要的地位，几乎所有的土壤过程都直接或间接地与土壤微生物有关[6-7]，因此，微生物在土壤中的分布与活动，能反映土壤各因素对微生物的生态分布、生物特性以及对其功能的影响和作用，揭示土壤生态系统的现状和趋向。土壤微生物群落对于土壤特性的变化非常敏感，故土壤微生物群落变化可以作为评价土壤生态系统可持续性的生物学指标[8]。硫丹在土壤中的残留势必影响土壤酶活性，目前研究涉及的土壤酶有脱氢酶、荧光素二乙酸脂水解酶、酸性磷酸酶、碱性磷酸酶、固氮酶、芳基硫酸酯酶和茁-d-葡糖苷酶等[9-10]，但硫丹对棕壤中微生物群落及酶活性的影响鲜见报道。本实验以低浓度（0~10mg·kg-1）硫丹染毒土壤，分别测定棕壤中脲酶、脱氢酶和茁-葡糖苷酶的变化，并且通过从土壤中抽提微生物总DNA，扩增细菌16SrDNA特异性片段，应用变性梯度凝胶电泳（PCR-DGGE），分析土壤细菌特异基因多态性，旨在揭示低浓度硫丹对棕壤中细菌群落结构的影响，并且为进一步探究硫丹对土壤生态系统的影响提供依据。1材料与方法1.1供试土壤与主要试剂以采自山东农业大学试验田（36毅10忆N，117毅9忆E）的棕壤为供试土壤，五点法取样，采集时除去土壤表面的杂草、枯叶和1cm左右的表层土，采集深度为0~15cm，过2mm筛。土壤的基本理化性质见表1。据调查，本实验中供试棕壤没有有机氯类农药使用历史，本实验前，采用气相色谱法[11]测定了供试棕壤中硫丹含量，结果为未检出。实验用硫丹原药购自德国Dr.Ehrenstorfer公司，纯度为96%；丙酮、氯化2，3，5-三苯基四唑（TTC）、硝基酚等试剂均为分析纯。1.2土壤染毒熊佰炼等[17]研究表明，琢-硫丹、茁-硫丹在土壤中的半衰期分别为32~99d和69~116d，随硫丹初始浓度不同而发生改变。Kong等[11]研究表明，当硫丹初始浓度为54.54mg·kg-1时，琢-硫丹、茁-硫丹的半衰期分别为53.3d和70.7d。本实验参考以上研究结果，设定实验硫丹浓度分别为0.1、1、10mg·kg-1，并设溶剂（丙酮）对照，实验设定3次重复。培养时间分别为7、14、21、28d。土壤含水量控制为田间最大持水量的60%，每隔3d调节一次土壤含水量。1.3土壤酶活性测定1.3.1土壤脲酶本实验用靛酚蓝比色法[12]，通过测定反应产生的氨量，计算土壤脲酶的活性。以每克干土培养24h后NH+4-N的微克数（滋gNH+4-N·g-1soil·h-1）表征。1.3.2土壤脱氢酶脱氢酶的活性用Tabatabai介绍的TTC分光光度法测定[13]：称取20.0g土壤置于50mL三角瓶中，加2.0mL1%氯化2，3，5-三苯基四唑（TTC）溶液，再加水至土壤最大持水量的90%，充分混匀后塞上塞子，放入37益的恒温培养箱中培养24h。培养结束后，加25mL甲醇，振荡5min，先用塞有脱脂棉的玻璃漏斗过滤，再用甲醇多次洗涤滤斗上的土壤，直至获得无色滤液。合并滤液和洗液，甲醇定容至100mL，摇匀后在485nm下比色测定其吸光值。酶活性单位为滋gTTC·g-1·h-1。1.3.3土壤茁-葡糖苷酶本实验用硝基酚-茁-D-葡糖苷作底物，采用硝基酚比色法[14]，测定土壤中茁-葡糖苷酶活性。1.4土壤细菌群落结构的PCR-DGGE分析和系统发育树的构建1.4.1土壤微生物总DNA提取采用POVERSOIL土壤DNA提取试剂盒（上海生表1供试土壤的理化性质Table1Physicalandchemicalcharacteristicsofsoilstudied土壤类型pH有机质/g·kg-1有效氮/mg·kg-1有效磷/mg·kg-1速效钾/mg·kg-1粘粒0.002mm/%砂粒0.05mm/%最大持水量/%棕壤7.617.6132.318.4125.710.457.742.42150第32卷第1期2014年11月图1硫丹对土壤中脲酶活性的影响Figure1Effectofendosulfanonureaseactivityinsoil不同字母表示同一暴露时间内不同浓度硫丹处理组脲酶活性的显著性差异（P0.05）。下同16141210864207142128t/daaaaaaaaaaaaaaaaCK0.1mg·kg-11mg·kg-110mg·kg-1工），称取0.5g于-20益保存的染毒土样，按操作步骤提取土壤微生物总DNA。采用SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒对粗提DNA进行纯化。将提取纯化得到的DNA样品与1滋L6伊LoadingBuffer混合，加入1.2%的琼脂糖凝胶的样品孔中，姿-HinddigestedMarker加入一端点样孔中，对提取的DNA进行电泳检测，在Bio-Rad的GelDocXR凝胶成像系统中观察纯化效果。1.4.2PCR扩增扩增采用可检测环境中数量较低微生物的巢式PCR（NestedPCR）扩增策略。第一次PCR引物为27F和1492R，第二次PCR引物为细菌16SrDNAV3区的338F-GC和518R[18]。扩增体系为50滋L，其中：10伊PCRBuffer5滋L；Mg2+5滋L；dNTPs（dATP，dCTP，dGTP，dTTP）2滋L；Primers（27F，1492R；10滋mol·L-1）2滋L伊2；模板DNA1滋L；Taq酶（5U·滋L-1）1滋L；ddH2O32滋L。扩增条件为：94益预变性5min，94益变性1min，58益退火1min，72益延伸1.5min，25个循环；72益，10min，最后于4益恒定保存。1.4.3PCR产物的变性梯度凝胶电泳（DGGE）分析取PCR