底物类型对产甲烷效能及微生物群落结构的影响王昊昱

第４８卷　第２期２０１６年２月　哈　尔　滨　工　业　大　学　学　报ＪＯＵＲＮＡＬＯＦＨＡＲＢＩＮＩＮＳＴＩＴＵＴＥＯＦＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ　Ｖｏｌ􀆰４８Ｎｏ􀆰２Ｆｅｂ．２０１６　　　　　　ｄｏｉ：１０．１１９１８／ｊ．ｉｓｓｎ．０３６７⁃６２３４．２０１６．０２．００２底物类型对产甲烷效能及微生物群落结构的影响王昊昱，陶　彧，任南琪（城市水资源与水环境国家重点实验室（哈尔滨工业大学），１５００９０哈尔滨）摘　要：为考察底物类型对厌氧消化过程的影响，以升流式厌氧膨胀床作为厌氧消化反应器，以经过“热－酶联合预水解”后的啤酒糟和猪粪作为处理对象，研究不同有机负荷率条件下反应器的运行效能和微生物群落结构．结果表明，当有机底物类型从啤酒糟转变为猪粪后，反应器的ＣＯＤ去除率降低４０％，甲烷产量减少７５％，有机物甲烷化率降低２５％，且出水乙酸质量浓度由５０ｍｇ／Ｌ跃升至３７００ｍｇ／Ｌ．同时，Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ细菌门的丰度提高约１倍，Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ细菌门的相对丰度则减少约５０％；产甲烷菌数量减少６１％，产甲烷菌属Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ替代Ｍｅｔｈａｎｏｓａｅｔａ成为最占优势的古细菌菌属．关键词：底物类型；有机负荷；厌氧消化；升流式厌氧膨胀床；微生物种群结构中图分类号：Ｘ１７２文献标志码：Ａ文章编号：０３６７－６２３４（２０１６）０２－０００９－０６ＩｍｐａｃｔｏｆｏｒｇａｎｉｃｍａｔｔｅｒｔｙｐｅｏｎｔｈｅｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙａｎｄｍｉｃｒｏｂｉａｌｃｏｍｍｕｎｉｔｙｓｔｒｕｃｔｕｒｅｏｆａｎａｎａｅｒｏｂｉｃｄｉｇｅｓｔｉｏｎｐｒｏｃｅｓｓＷＡＮＧＨａｏｙｕ，ＴＡＯＹｕ，ＲＥＮＮａｎｑｉ（ＳｔａｔｅＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＵｒｂａｎＷａｔｅｒＲｅｓｏｕｒｃｅａｎｄＥｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ（ＨａｒｂｉｎＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），１５００９０Ｈａｒｂｉｎ，Ｃｈｉｎａ）Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｉｎｏｒｄｅｒｔｏｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｔｈｅｉｍｐａｃｔｏｆｏｒｇａｎｉｃｍａｔｔｅｒｔｙｐｅｏｎｔｈｅｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙａｎｄｍｉｃｒｏｂｉａｌｃｏｍｍｕｎｉｔｙｓｔｒｕｃｔｕｒｅｄｕｒｉｎｇａｎａｅｒｏｂｉｃｄｉｇｅｓｔｉｏｎｏｐｅｒａｔｉｏｎ，ａｎｅｘｐａｎｄｅｄｇｒａｎｕｌａｒｓｌｕｄｇｅｂｅｄ（ＥＧＳＢ）ｗａｓａｐｐｌｉｅｄｔｏｔｒｅａｔｂｒｅｗｅｒｙｓｐｅｎｔｇｒａｉｎｈｙｄｒｏｌｙｓａｔｅｓ（ＢＳＧＨ）ａｎｄｐｉｇｍａｎｕｒｅｈｙｄｒｏｌｙｓａｔｅｓ（ＰＭＨ）ｔｈａｔｗｅｒｅｐｒｅ⁃ｈｙｄｒｏｌｙｚｅｄｂｙｓｐｅｃｉｆｉｃｅｎｚｙｍｅｓｕｎｄｅｒｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｃｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ．ＲｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔａｆｔｅｒｔｈｅｏｒｇａｎｉｃｍａｔｔｅｒｏｆＢＳＧＨｗａｓａｌｔｅｒｅｄｂｙＰＭＨ，ａｓｅｒｉｅｓｄｅｃｒｅａｓｅｏｆ４０％，７５％ａｎｄ２５％ｗａｓｏｂｓｅｒｖｅｄｆｏｒｔｈｅｂｕｌｋＣＯＤｒｅｍｏｖａｌ，ｍｅｔｈａｎｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎａｎｄｏｒｇａｎｉｃｂｉｏｍｅｔｈａｎａｔｉｏｎｒａｔｅ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｍｅａｎｗｈｉｌｅ，ｔｈｅａｃｅｔｉｃａｃｉｄｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｉｎｔｈｅｅｆｆｌｕｅｎｔｉｎｃｒｅａｓｅｄｆｒｏｍ５０ｍｇ／Ｌｔｏ３７００ｍｇ／Ｌ．Ｆｏｒｔｈｅｍｉｃｒｏｂｉａｌｃｏｍｍｕｎｉｔｙ，ｔｈｅａｂｕｎｄａｎｃｅｏｆＦｉｒｍｉｃｕｔｅｓｄｏｕｂｌｅｄａｆｔｅｒｔｈｅｓｕｂｓｔｒａｔｅｔｙｐｅｃｈａｎｇｉｎｇ，ｗｈｉｌｅＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓｄｅｃｒｅａｓｅｄ５０％ｉｎｓｔｅａｄ．Ｔｈｅｑｕａｎｔｉｔｙｏｆｍｅｔｈａｎｏｇｅｎｓｄｒｏｐｐｅｄｂｙ６１％ａｎｄｔｈｅｐｒｅｖｉｏｕｓｌｙｍｏｓｔａｂｕｎｄａｎｔｇｅｎｕｓＭｅｔｈａｎｏｓａｅｔａｗａｓｒｅｐｌａｃｅｄｂｙＭｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ．Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ｓｕｂｓｔｒａｔｅｔｙｐｅ；ｏｒｇａｎｉｃｌｏａｄｉｎｇ；ａｎａｅｒｏｂｉｃｄｉｇｅｓｔｉｏｎ；ＥＧＳＢ；ｍｉｃｒｏｂｉａｌｃｏｍｍｕｎｉｔｙｓｔｒｕｃｔｕｒｅ收稿日期：２０１５－０６－２０．基金项目：国家水专项（２０１３ＺＸ０７２０１００７）．作者简介：王昊昱（１９８５—），女，博士研究生；任南琪（１９５９—），男，博士生导师，中国工程院院士．通信作者：任南琪，[e-mail]．　　在众多新能源项目中，生物质能源因兼顾废物处理与能源回收而获得重视［１］．许多农牧业有机废物，例如秸秆［２］、家畜粪便［３］等，均已被证实能够通过中温或者高温厌氧消化的方式转变为生物质气体．但是，直接以上述有机废物作为底物进行厌氧消化的效率往往较低［４］，限制了该技术的推广．近年来，发现对有机废物进行适当的预处理可以大幅提高后续厌氧消化的效率［５］．例如，本团队曾借助“热－酶联合预水解法”成功实现了对啤酒糟和猪粪的预处理，相比直接处理上述底物，该预处理方法将厌氧消化的效能提高了５～７倍［６］．对于应用规模的厌氧消化反应器，在实际运行过程中往往会接纳不同类型的有机物．有研究指出，底物类型的转变对厌氧消化过程的影响较大，主要体现在对厌氧消化产甲烷效率［７］以及对微生物种群组成的的影响［８－９］．目前关于底物类型对厌氧消化过程的效能及微生物种群影响方面的报道较少．本研究以经过“热－酶联合预水解”后的啤酒糟（ｂｒｅｗｅｒｙｓｐｅｎｔｇｒａｉｎｈｙｄｒｏｌｙｓａｔｅｓ，ＢＳＧＨ）和猪粪（ｐｉｇｍａｎｕｒｅｈｙｄｒｏｌｙｓａｔｅｓ，ＰＭＨ）为处理对象，以升流式厌氧膨胀床（ｅｘｐａｎｄｅｄｇｒａｎｕｌａｒｓｌｕｄｇｅｂｅｄ，ＥＧＳＢ）作为厌氧消化过程的载体，考察依次以ＢＳＧＨ和ＰＭＨ作为有机底物时ＥＧＳＢ反应器的厌氧消化效能，包括2015-11-1311:27:01化学需氧量（ｃｈｅｍｉｃａｌｏｘｙｇｅｎｄｅｍａｎｄ，ＣＯＤ）的去除情况、挥发性有机酸（ｖｏｌａｔｉｌｅｆａｔｔｙａｃｉｄｓ，ＶＦＡｓ）的累积以及产甲烷的效率．此外，借助高通量测序以及定量ＰＣＲ等分子生物学手段考察了反应器内的微生物群落对底物变化的响应．１　实　验１．１　ＥＧＳＢ反应器ＥＧＳＢ反应器主体由双层玻璃制成（见图１），有效容积为３．８Ｌ．利用水浴维持反应器内的温度（３５±１）℃．蠕动泵Ｐ１为进水泵，Ｐ２为出水回流泵．通过Ｐ２高速运转实现反应器内的上升流速８ｍ／ｈ，从而保障反应器内液体的膨胀状态．借助置于反应器顶部的ｐＨ、ＯＲＰ和铵离子质量浓度探头实时监测上述３个指标的数值变化并通过数据记录仪存储数据．为了防止极端ｐＨ造成反应器的不稳定，通过酸碱平衡装置将ｐＨ维持在６．９～７．１．具体做法是当反应器内ｐＨ低于６．９时，利用微量蠕动泵向反应器内滴加０．１ｍｍｏｌ／Ｌ的ＮａＯＨ溶液，当反应器内ｐＨ高于７．１时，滴加０．０１ｍｍｏｌ／Ｌ的ＨＣｌ溶液．采用德国Ｒｉｔｔｅｒ公司生产的ＭＧＣ－１ＰＭＭＡ型气体流量计对生物质气体的产生量进行实时监测，并借助安捷伦公司生产的ＨＰ７８９０Ａ型气相色谱检测生物质气体中甲烷的质量分数，计算产甲烷速率．采用某土豆深加工厂污水厌氧处理设备的成熟颗粒污泥作为接种污泥．数据记录仪出水口水浴管线pH探头及酸碱平衡装置氧化还原电位探头铵离子浓度探头生物质气体排放口气体流量计进水口水浴P1P2图１　ＥＧＳＢ反应器装置１．２　底物预处理过程采用热－酶联合预水解方法对啤酒糟和猪粪分别进行预处理，步骤见文献［６］．对啤酒糟的预处理过程主要包含以下步骤：首先，对啤酒糟在ｐＨ１０．７、９０℃条件下热处理４ｈ；依次采用荷兰ＤＳＭ公司生产的Ｄｅｌｖｏｌａｓｅ®蛋白酶（单独使用）、Ｆｉｌｔｒａｓｅ®ＮＬ纤维素水解酶和Ｂａｋｅｚｙｍｅ®ＡＲＡ１０．０００半纤维素水解酶（同时使用）对底物进行酶解，具体条件如表１所示；最后，为了排除无机颗粒或难降解残渣对后续厌氧消化的不利影响，采用瑞士Ｓｅｆａｒ公司生产的ＳＥＦＡＲＴＥＴＥＸ®０５－６－４５６Ｋ型聚丙烯网纱对水解后的混合液进行过滤并回收滤出液（即ＢＳＧＨ）．对猪粪的预处理过程与啤酒糟的处理过程相似，不同点在于将Ｄｅｌｖｏｌａｓｅ®蛋白酶与Ｄｅｌｖｏｚｙｍｅ®蛋白酶同时使用．ＢＳＧＨ和ＰＭＨ底物的主要成分如表２所示．表１　酶水解过程的最优条件名称ｐＨｔ／℃处理时间／ｈＤｅｌｖｏｌａｓｅ®８．０６０４Ｄｅｌｖｏｚｙｍｅ®８．０６０４Ｆｉｌｔｒａｓｅ®ＮＬ４．５５０２０Ｂａｋｅｚｙｍｅ®ＡＲＡ１０．０００４．５５０２０表２　经热－酶预处理后啤酒糟和猪粪的成分ｇ·ｋｇ－１参数ＢＳＧＨＰＭＨＴＳ７４５８ＶＳ６３４０无机物１２１９蛋白质—７ＣＯＤ１００４１甘油１３．４１５．３乙酸１．２１．０葡萄糖４．５９０．８７木糖６．９５０．８５阿拉伯糖３．３００．５６总氮３．５４２．７７有机氮—１．１７氨氮０．２４１．６０磷０．４８０．８２硫０．２７０．７１钠４．９３３．７０氯化物２．７０—钙０．１８２．２３镁０．１２１．１８钾０．０４１．０９铜０．０６０．６０铁０．７３１．０９锌０．４５４．２２镍＜０．０１０．０５钴０．０１０．０３铬＜０．０１＜０．０１钼＜０．０１＜０．０１锰０．１８４．４９１．３　常规分析项目与方法采用德国ＭＥＲＣＫ公司生产的ＣＯＤ和氨氮质量浓度测定试剂盒及ＴＲ４２０／ＮＯＶＡ６０型分光光度计对上述指标进行检测．溶解性ＣＯＤ样品测定前，采用英国Ｗｈａｔｍａｎ公司生产的Ｓｐａｒｔａｎ３０型０．４５μｍ滤膜对样品进行过滤．挥发酸和甲烷成分的测定分别由配备ＦＩＤ检测器和ＴＣＤ检测器的安捷·０１·哈　尔　滨　工　业　大　学　学　报　　　　　　　　　　　　　第４８卷　伦ＨＰ７８９０型气相色谱完成．上述指标的测定过程采用平行样品测定以减少仪器误差．总ＣＯＤ去除率、溶解性ＣＯＤ去除率及有机物甲烷化率的计算公式如下：　　总ＣＯＤ去除率＝（ＣＯＤ进水－ＣＯＤ出水）ＣＯＤ进水×１００％，　　溶解性ＣＯＤ去除率＝　　（溶解性ＣＯＤ进水－溶解性ＣＯＤ出水）溶解性ＣＯＤ进水×１００％，　　有机物甲烷化率＝２．６６×Ｖ甲烷Ｑ×ＣＯＤ进水×１００％．式中：ＣＯＤ进水、ＣＯＤ出水分别为进、出水总ＣＯＤ，ｇ／Ｌ；溶解性ＣＯＤ进水、溶解性ＣＯＤ出水分别为进、出水溶解性ＣＯＤ，ｇ／Ｌ；２．６６为室温下单位体积甲烷所对应的化学需氧量系数；Ｖ甲烷为产甲烷体积，Ｌ／ｄ；Ｑ为反应器的进水流量，Ｌ／ｄ．１．４　分子生物学分析方法为了表征反应器污泥中细菌和古细菌的数量及其群落结构，对接种污泥以及第８、３４、５６和７６天的污泥样品进行ＤＮＡ提取和定量ＰＣＲ、高通量测序分析．此外，为了考察处于反应器不同高度的污泥中细菌和古细菌的数量，在反应器运行非常稳定阶段（第５６天）从反应器上、中、下３个取样口分别取样．利用美国ＭｏＢｉｏ实验室生产的ＭｏＢｉｏＵｌｔｒａＣｌｅａｎ细菌ＤＮＡ提取试剂盒对污泥样品进行ＤＮＡ提取，提取后的ＤＮＡ样品一部分用于４５４－焦磷酸高通量测序，另一部分用于定量ＰＣＲ分析．定量ＰＣＲ实验采用美国ＡＢＩ公司生产的ＡＢＩ７５００型ｑＰＣＲ分析仪完成，采用的特异性引物如表３所示．引物和ＳＹＢＲＰｒｅｍｉｘＥｘＴａｑＫｉｔ预混装试剂盒购自工生物工程（上海）股份有限公司，依照预混装试剂盒使用说明书配置反应体系．细菌ｑＰＣＲ分析过程的条件为：９５℃预变性６０ｓ，９５℃循环变性１５ｓ，５３℃退火复性３０ｓ，７２℃延伸４５ｓ，进行４０个循环；古细菌ｑＰＣＲ分析过程的条件为：９５℃预变性６０ｓ，９５℃循环变性１０ｓ，６１℃退火复性３０ｓ，７２℃延伸４５ｓ，进行４０个循环．全部定量ＰＣＲ待测样品均经过３次重复测定取平均值．另一部分ＤＮＡ样品送美国Ｒ＆Ｔ实验室进行４５４－焦磷酸测序（罗氏４５４ＧＳ－ＦＬＸ系统）．选择Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ正向引物序列Ｕ５１５Ｆ（‘５－ＧＴＧＹＣＡＧＣＭＧＣＣＧＣＧＧＴＡＡ－３’）和反向引物序列Ｕ１０７１Ｒ（‘５－ＧＡＲ