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第六章现代生物技术与环境污染治理第一节现代生物技术概况一、现代生物技术概述■生物技术（biotechnology）是指人们以现代生物科学为基础，结合先进的工程技术手段和其他基础学科的科学原理，按照预先的设计改造生物体或加工生物原料，为人类生产出所需产品或达到某种目的。(一)生物技术的内容■现代生物技术主要包括基因工程酶工程细胞工程发酵工程■基因工程技术是核心技术，它能带动其他技术的发展，如通过基因工程对细菌或细胞改造后获得的工程菌或细胞，必须通过发酵工程或细胞工程来生产有用物质。（二）生物技术的种类及其相互关系1.种类（1）基因工程Geneengineering■应用人工方法将生物的遗传物质在体外进行切割、拼接和重组。■将重组了的DNA导入某种宿主细胞或个体，从而改变他们的遗传品性或获得基因产物。（2）细胞工程cellengineering■以细胞为基本单位，在体外条件下进行培养、繁殖，或人为地使细胞某些生物学特性按人们的意愿发生改变，从而达到改良生物品种和创造新品种，加速繁育动植物个体，或获得某种有用的物质的过程。■包括：动植物细胞的体外培养技术细胞融合技术细胞器移植技术等。（3）酶工程Enzymeengineering■利用酶、细胞器或细胞所具有的特异催化功能，或对酶进行修饰改造，并借助于生物反应器和工艺过程来生产人类所需产品的一项技术。■包括：酶的固定化技术细胞的固定化技术酶的修饰改造技术酶反应器的设计技术（4）发酵工程Fermentationengineering■利用微生物生长速度快、生长条件简单以及代谢过程特殊等特点，在合适条件下，通过现代化工程技术手段，由微生物的某种特定功能生产出人类所需的产品的过程。（5）蛋白质工程Proteinengineering■在基因工程的基础上，结合蛋白质结晶学、计算机辅助设计和蛋白质化学等多学科的基础知识，通过对基因的人工定向改造等手段，从而达到对蛋白质进行修饰、改造、拼接以产生能满足人类需要的新型蛋白质。2.相互关系现代生物技术涉及的学科生物化学分子生物学微生物学遗传学细胞生物学化学工程农业生物技术医药生物技术生物技术疫苗生物技术诊断家畜生物技术海洋生物技术环境生物技术现代生物技术生物技术树形图（三）生物技术的基本特征■高效益可带来高额利润■高智力具有创造性和突破性■高竞争时效性的竞争非常激烈■高投入前期研究及开发需要大量资金投入■高风险竞争的激烈，必然带来高风险■高势能对国家的政治、经济和文化及社会发展有很大的影响，具有很高的态势和潜在的能量（四）生物技术所涉及的行业种类疾病治疗用于控制人类疾病诊断临床检测，食品、环境检测农林与园艺新型农作物、动物食品扩大食品、饮料的来源环境废物处理、生物净化化学品酶、核酸类及特殊化学品设备生物技术所需的设备二、环境生物技术1.一般概念■应用于认识和解决环境问题过程的生物技术体系，包括对环境污染效应的认识、环境质量评价和环境污染的生物处理技术等。（教材）■直接或间接利用生物或生物体的某些组成成分或某些机能，建立降低或消除污染物产生的工艺过程，或者能够高效净化环境污染，同时又生产有用物质的工程技术。清华《现代环境生物技术》2.广义概念■凡是自然界中涉及环境污染控制的一切与生物技术有关的技术。■德国生物技术中心Timmis博士认为(1)在环境中应用的生物技术，这是相对于一些高度控制条件下的密闭反应器中进行的生物技术而言。(2)涉及到环境中某些可以看作为一个生物反应器部分的生物技术。(3)作用于一些必定要进入环境的材料的生物技术。■美国密歇根州立大学的Tiedje教授认为，环境生物技术的核心是微生物学过程。3.环境生物技术可分为3个层次■高层次：以基因工程为主导的现代污染防治生物技术，如基因工程菌的构建、抗污染物转基因植物的培育等；■中层次：指传统的生物处理技术，如活性污泥法、生物膜法，及其在新的理论和技术背景下产生的强化处理技术和工艺，如生物流化床、生物强化工艺等；■低层次：利用天然处理系统进行废物处理的技术，如氧化塘、人工湿地系统等。■三种层次均是污染治理不可缺少的生物技术手段。4.环境生物技术研究范围■解决基因工程菌从实验室进入模拟系统和现场应用过程中，其遗传稳定性、功能高效性和生态安全性等方面的问题；■开发废物资源化和能源化技术，利用废物生产单细胞蛋白、生物塑料、生物肥料以及利用废物生产生物能源，如甲烷、氢气、乙醇等；■建立无害化清洁生产新工艺，如生物制浆、生物絮凝剂、煤的生物脱硫、生物冶金等；■发展对环境污染物的生理毒性及其对生态环境影响的检测技术。第二节基因工程与环境污染生物治理一、基因工程的分子生物学基础1.核酸的结构与功能核酸是一类由各种核苷酸聚合而成的生物大分子。(1)核酸分类脱氧核糖核酸（DNA）核糖核酸（RNA）核苷酸结构(1)碱基—糖之间是β—糖苷键(2)糖—磷酸之间是磷酸酯键（2）DNA结构A、两条反向平行的核苷酸链共同盘绕形成双螺旋，糖－磷酸－糖构成螺旋主链B、两条链的碱基都位于中间，碱基平面与螺旋轴垂直。C、两条链对应碱基呈配对关系A＝TG≡CD、螺旋直径2nm，螺距3.4nm，每一螺距中含10bp（3）DNA的复制DNA复制特点：■从特定的位点开始■半保留复制■具有高保真性■多种酶和蛋白因子共同作用的结果（4）DNA的变性、复性与杂交■变性在加热或某些试剂的作用下，DNA配对碱基之间的氢键结构受到破坏，双链DNA的多核苷酸链能完全分离，分离过程称为变性（denaturation）或熔解（melting）。■复性变性DNA在一定条件下能恢复其双螺旋结构，这个过程叫DNA复性（renaturation）。■杂交当复性的DNA分子由不同的两条单链分子形成时，称为杂交（hybridization）。DNA的变性与复性（5）核酸的功能■贮藏遗传信息的功能■传递遗传信息的功能■表达遗传信息的功能Crick提出中心法则■确定遗传信息由DNA通过RNA流向蛋白质的普遍规律。遗传信息的传递方向——中心法则DNA通过以自身为模板进行复制而使遗传信息代代相传，并通过RNA最终将遗传信息传给蛋白质分子。遗传信息储存在核酸中遗传信息由核酸流向蛋白质RNA的转录（1）以DNA为模板，在RNA聚合酶的催化下合成RNA的过程称为转录。（2）转录是基因表达的关键一步，DNA分子中所储存的遗传信息，必须转录成信使RNA（mRNA）才能通过蛋白质生物合成的过程变成具有生物活性的蛋白质。翻译——蛋白质的生物合成■以RNA为模板合成蛋白质的过程叫翻译。■通过转录将储存在DNA分子中的遗传信息传递给为蛋白质编码的mRNA，翻译就是将以核苷酸形式编码在mRNA中的信息转变成多肽链中特定的氨基酸顺序。■翻译过程是一个很复杂的生物反应过程，需要大约二百多种以上的生物大分子，其中包括核糖体、mRNA、tRNA、氨酰tRNA合成酶、各种可溶性的蛋白因子等参加并协同进行。真核生物蛋白质合成过程中外显子和内含子的关系蛋白质mRNAmRNA前体DNA外显子1内含子1外显子2内含子2外显子3内含子3外显子4剪接翻译原核生物的操纵子模型■1961年F.Jacob和J.Monod通过不同的大肠杆菌乳糖代谢突变体的研究，提出了操纵子模型学说（operontheory）。■生物活性相关基因组织在一起进行统一的调控，并保持各基因产物的精确比例。乳糖操纵子真核生物基因结构什么是基因？■根据目前人们的认识，基因应该是能够表达和产生基因产物的DNA（RNA）序列。■根据产物类别分为：Protein基因、RNA基因（tRNA基因和rRNA基因）两大类。■根据产物功能分为：结构基因（酶和不直接影响其他基因表达的蛋白质）和调节基因（阻遏蛋白或转录激活因子）。■概括起来基因就是一段含有特定遗传信息的核苷酸序列，是遗传物质的最小功能单位。二、基因工程的基本过程■带有目的基因的DNA片段的获取■在体外，将带有目的基因的DNA片段连接到载体上，形成重组DNA分子■重组DNA分子导入受体细胞（也称宿主细胞或寄主细胞）■带有重组体的细胞扩增，获得大量的细胞繁殖群体剪、接、转、筛第二节基因工程与环境污染生物治理基因工程实验的一般步骤1973年Cohen和Boyer开展的基因重组示意图基因工程的四大要素■工具酶（限制性内切酶、聚合酶、连接酶等）■载体（类型、性质、用途）■目的基因（获取基因的方法）■受体细胞（大肠杆菌细胞、酵母细胞、动植物细胞）三、工具酶常用的工具酶工具酶名称主要功能限制性核酸内切酶在DNA分子内部的特异性的碱基序列内部进行切割DNA连接酶将两条以上的线性DNA分子或片段催化形成磷酸二酯键连接成一个整体DNA聚合酶I通过向3’端逐一增加核苷酸以填补双链DNA分子上的单链裂口，即5’→3’DNA聚合酶活性与3’→5’及5’→3’外切酶活性多核苷酸激酶催化将把一个磷酸分子加到多核苷酸链的5’－OH末端上反转录酶以RNA或DNA链为模板合成互补的cDNA链DNA末端转移酶将寡聚物尾巴加到了线性双链或单链DNA分子的3’－OH末端或DNA的3’－末端标dNTP第二节基因工程与环境污染生物治理常用的工具酶(续上表格)工具酶名称主要功能碱性磷酸酶去除DNA,RNA,dNTP的5’磷酸基团核酸外切酶III降解DNA3’－OH末端的核苷酸残基降解酶S1降解单链DNA或RNA,产生带5’磷酸的单核苷酸或寡聚核苷酸，同时也可切割双链核酸分子的单链核酸酶Bal31降解双链DNA,RNA的5’及3’末端TaqDNA聚合酶能在高温（72℃）下的单链DNA为模板，从5’→3’方向合成新生的互补链核糖核酸酶专一性降解RNA脱氧核糖核酸酶内切核酸酶，水解单链或双链DNA1.限制性核酸内切酶(restrictionenzyme)■细菌的限制-修饰系统（R-MSystem）■限制性核酸内切酶类型■II型限制性核酸内切酶性质和作用特点（1）细菌的限制-修饰系统（R-MSystem）■1965年，Arber等提出：细胞中存在位点特异性限制酶和特异性甲基化酶，即细胞中有限制—修饰系统(Restriction-modificationsystem)。■甲基化是常见的修饰作用，可使腺嘌呤A成为N6甲基-腺膘呤，胞嘧啶C成为5’甲基胞嘧啶。■R-M系统是细菌安内御外的积极措施。嘧啶Py嘌呤Pu甲基化位置由宿主控制的限制与修饰作用由甲基转移酶和限制性核酸内切酶两种酶活性配合进行的5’---------------GAATTC--------------3’3’---------------CTTAAG---------------5’EcoRIMEcoRI限制作用修饰作用---G3’5’AATTC---3’5’---GAATTC---3’---CTTAA5’3’G---5’3’---CTTAAG---5’+EcoRIEcoRI与MEcoRI的限制与修饰作用机理（2）限制性核酸内切酶类型ⅡⅠⅢ酶分子内切酶与甲基化酶分子不在一起三亚基双功能酶(R，M，S亚基)二亚基双功能酶识别位点4-6bp,大多数为回文对称结构非对称5-7bp非对称切割位点在识别位点中或靠近识别位点无特异性，至少在识别位点外1000bp在识别位点下游24-26bp限制反应与甲基化反应分开的反应互斥同时竞争限制作用是否需用ATPNoYesYes（3）II型限制性内切酶性质和作用特点■限制酶：同源二聚体（homodimer），由两个彼此按相反方向结合在一起的相同亚单位组成。■修饰酶：单体■识别回文对称序列（palindromesequence），在回文序列内部或附近切割DNA，产生带3‘-羟基和5’-磷酸基团的DNA产物，需Mg2+，相应的修饰酶只需SAM。■识别序列主要为4-6bp，或更长且呈二重对称的特殊序列。特点：识别序列和切割位点的双特异性限制酶产生的末端：匹配粘端（matchedend）和平末端（Bluntend）EcoRⅠG▼AATTCHindⅢA▼AGCTTCTTAA▼GTTCGA▼ASmaICCC▼GGGEcoRVGAT▼ATCGGG▼CCCCTA▼TAG