第九章吸光光度法

第九章吸光光度法9.1吸光光度法的特点和基本原理9.2目视比色法和光度计的基本部件9.3显色反应和显色条件的选择9.4吸光度测量条件的选择9.5吸光光度法的应用1．了解吸光光度法的特点；2．理解并掌握吸光光度法的原理，掌握朗伯—比尔定律的数学表达式及其意义并能进行有关计算；3．了解吸光光度分析方法和分光光度计基本原理和结构。4．了解显色反应的要求，掌握显色反应条件的选择；5．掌握测量条件的选择.学习目标9.1吸光光度法的特点吸光/分光光度法是基于物质分子对光的选择性吸收而建立起来的分析方法。按物质吸收光的波长不同，可分为比色法、可见分光光度法、紫外分光光度法及红外分光光度法。特点：*灵敏度较高（10-5~10-6mol·L-1），适用于微量组分的测定。相对误差较大（2~5%）。*具有操作方便、仪器设备简单、灵敏度和选择性较好等优点，为常规的仪器分析方法。化学分析与仪器分析方法比较光度法：结果0.048%～0.052%,满足要求容量法：V(K2Cr2O7)≈0.02mL,测不准重量法：m(Fe2O3)≈0.14mg,称不准例:含Fe约0.05%的样品,称0.2g,则m(Fe)≈0.1mg光度分析：微量组分(10-3～10-6),相对误差2%～5%依据物理或物理化学性质,需要特殊的仪器化学分析：常量组分(1%),相对误差0.1%～0.2%依据化学反应,使用玻璃仪器准确度高灵敏度高白光通过有色溶液，发生透射，散射，反射和吸收现象；被照物质为均匀溶液时，散射可以忽略。9.1吸光光度法的基本原理•光是一种电磁波。所有电磁波都具有波粒二象性。光的波长、频率与光速c的关系为：（9-1）•光速在真空中等于2.9979×108m·s-1。光子的能量与波长的关系为：（9-2）式中E为光子的能量；v为频率；h为普朗克常数，为6.626×10-34J·S。chc/hE一、物质的颜色及对光的选择性吸收远紫外近紫外可见近红外中红外远红外（真空紫外）10nm~200nm200nm~380nm380nm~780nm780nm~2.5m2.5m~50m50m~300m光学光谱区二、物质的颜色与光的关系•单色光:只具有一种波长的光。•混合光:由两种以上波长组成的光。•白光:是由红、橙、黄、绿、青、蓝、紫等各种色光按一定比例混合而成的。•物质的颜色:是由于物质对不同波长的光具有选择性的吸收作用而产生的。例如：硫酸铜溶液因吸收白光中的黄色光而呈蓝色；高锰酸钾溶液因吸白光中的绿色光而呈紫色。因此，物质呈现的颜色和吸收的光颜色之间是互补关系。如果把两种适当颜色的光按一定的强度比例混合可得白光，这两种光就叫互补色光。如果吸收光在可见区,吸收光的颜色与透过光的颜色为互补关系,物质呈现透过光的颜色。如果吸收光在紫外区，则物质不呈现颜色。光的互补性与物质的颜色光的互补:两种不同颜色的单色光按一定的强度比例混合得到白光，称这两种单色光为互补色光，这种现象称为光的互补。蓝黄紫红绿紫黄绿绿蓝橙红蓝绿/nm颜色互补光400-450紫黄绿450-480蓝黄480-490绿蓝橙490-500蓝绿红500-560绿红紫560-580黄绿紫580-610黄蓝610-650橙绿蓝650-760红蓝绿•分子、原子、离子具有不连续的量子化能级，当照射光子的能量hv与被照射粒子的E激－E基＝（hv）n时才能发生吸收。•不同物质微粒的结构不同，有不同的量子化能级，其能量差也不同，因此物质对光的吸收具有选择性。•若固定某一溶液的浓度C和液层厚度b，测量不同λ下的吸光度A，以吸光度A对吸收波长λ作图，就得到－吸收曲线，即吸收光谱。吸收光谱或吸收曲线测定某种物质对不同波长单色光的吸收程度，以波长为横坐标，吸光度为纵坐标作图。KMnO4溶液对波长525nm附近的绿色光吸收最强，而对紫色光吸收最弱。光吸收程度最大处的波长叫做最大吸收波长，用max表示。不同浓度的KMnO4溶液所得的吸收曲线都相似。KMnO4溶液的吸收曲线(cKMnO4:abcd)max苯(254nm)甲苯(262nm)A230250270苯和甲苯在环己烷中的吸收光谱形状及max均不同吸收光谱或吸收曲线定性分析基础不同的物质具有不同的分子结构，其吸收曲线形状和最大吸收波长各不相同，可对物质进行定性分析。定量分析基础不同浓度的同一物质，其最大吸收波长不变，在吸收峰及附近处，吸光度随浓度增大而增大，可对物质进行定量分析。KMnO4溶液的吸收曲线(cKMnO4:abcd)maxVIS-7220分光光度计吸光度测量仪器——分光光度计三、光的吸收定律—朗伯-比尔定律kcbIIA0lg(9-3)1.朗伯定律（1760年）A=lg(I0/I)=k'b2.比尔定律（1852年）A=lg(I0/I)=k”c吸光度与光程的关系A=bc光源检测器0.00吸光度检测器b样品光源0.22吸光度光源检测器0.44吸光度b样品b样品吸光度与浓度的关系A=bc吸光度0.00光源检测器吸光度0.22光源检测器b吸光度0.44光源检测器b1倍浓度2倍浓度I0－入射光强度I－透射光强度T－透光率（透射比）T=I/I0A－吸光度光的吸收基本定律▲朗伯－比尔定律:A=lg(I0/I)=lg(1/T)=-lgT=kbcb－溶液厚度(cm)；c－溶液浓度注意：吸光度A无量纲单位。1.吸光系数－a当c的单位用g·L-1表示时，用a表示.A＝abca的单位:L·g-1·cm-12.摩尔吸光系数－当c的单位用mol·L-1表示时，用表示.A＝bc的单位:L·mol-1·cm-1ε与a的关系为:ε=Ma上式中，M为吸光物质的摩尔质量朗伯－比尔定律中比例系数的表示类型例9-1浓度为25.0μg/50mL的Cu2+溶液，用双环已酮草酰二腙分光光度法测定，于波长600nm处，用2.0cm比色皿测得T=50.1%，求吸光系数a和摩尔吸光系数。已知M(Cu)=64.0。解已知T=0.501，则A=－lgT=0.300，b=2.0cm,则根据朗伯—比尔定律A=abc，而ε=Ma=64.0g·mol-1×3.00×102L·g-1·cm-1=1.92×104(L·mol-1·cm-1))1000.5100.50100.251436LgLgc（11-214.L.g103.001000.50.2300.0cmLgcmbcAa例9-2某有色溶液，当用1cm比色皿时，其透光度为T，若改用2cm比色皿，则透光度应为多少？解:由A=-lgT=abc可得T=10-abc当b1=1cm时，T1=10-ac=T当b2=2cm时，T2=10-2ac=T2定量分析时，通常液层厚度是相同的，按照比尔定律，浓度与吸光度之间的关系应该是一条通过直角坐标原点的直线。但在实际工作中，往往会偏离线性而发生弯曲，见图9-4中的虚线。若在弯曲部分进行定量，将产生较大的测定误差。四、偏离朗伯一比尔定律的原因图9-4对比尔定律的偏离情况朗伯一比尔定律只对一定波长的单色光才能成立，但在实际工作中，即使质量较好的分光光度计所得的入射光，仍然具有一定波长范围的波带宽度。在这种情况下，吸光度与浓度并不完全成直线关系，因而导致了对朗伯一比尔定律的偏离。所得入射光的波长范围越窄，即“单色光”越纯，则偏离越小。1.单色光不纯所引起的偏离2.由于溶液本身的原因所引起的偏离朗伯—比尔定律是建立在均匀、非散射的溶液这个基础上的。如果介质不均匀，呈胶体、乳浊、悬浮状态，则入射光除了被吸收外，还会有反射、散射的损失，因而实际测得的吸光度增大，导致对朗伯—比尔定律的偏离。3.溶质的离解、缔合、互变异构及化学变化也会引起偏离。其中有色化合物的离解是偏离朗伯—比尔定律的主要化学因素。例如，显色剂KSCN与Fe3+形成红色配合物Fe(SCN)3，存在下列平衡：Fe(SCN)3Fe3++3SCN－溶液稀释时，上述平衡向右，离解度增大。所以当溶液体积增大一倍时，Fe(SCN)3的浓度不止降低一半，故吸光度降低一半以上，导致偏离朗伯—比尔定律。朗伯-比尔定律适用范围•较高浓度（0.01mol/L)的溶液中，粒子之间相互作用力较强，对于吸光能力影响较大。浓度越高，A与c的关系就越偏离线性。•通常认为：朗伯-比尔定律仅适用于稀溶液。1.目视比色法9.2目视比色法和光度计的基本部件方便、灵敏，准确度差。常用于限界分析。c4c3c2c1c1c2c3c4观察方向2.光电比色法通过滤光片得一窄范围的光(几十nm)光电比色计结构示意图灵敏度和准确度较差3.吸光光度法和分光光度计通过棱镜或光栅得到一束近似的单色光.波长可调,故选择性好,准确度高.光源单色器吸收池检测系统稳压电源分光光度计工作流程示意图二.分光光度计的主要部件•1.光源：发出所需波长范围内的连续光谱，有足够的光强度,稳定。–可见光区：钨灯，碘钨灯(320～2500nm)–紫外区：氢灯，氘灯(180～375nm)•2.单色器：将光源发出的连续光谱分解为单色光的装置。–棱镜:玻璃350～3200nm,石英185～4000nm–光栅:波长范围宽,色散均匀,分辨性能好,使用方便3.吸收池：(比色皿)用于盛待测及参比溶液。可见光区：光学玻璃池紫外区：石英池4.检测器：利用光电效应，将光能转换成电流讯号。光电池，光电管，光电倍增管5.显示器：低档仪器：刻度显示中高档仪器：数字显示，自动扫描记录单色器介绍A.棱镜：依据不同波长光通过棱镜时折射率不同入射狭缝准直透镜棱镜聚焦透镜出射狭缝白光λ1λ2800600500400B.光栅：在镀铝的玻璃表面刻有数量很大的等宽度等间距条痕(600、1200、2400条/mm)。原理：利用光通过光栅时发生衍射和干涉现象而分光.M1M2出射狭缝光屏透镜平面透射光栅光栅衍射示意图检测器介绍A.硒光电池B.光电管红敏管625-1000nm蓝敏管200-625nmNi环（片）碱金属光敏阴极hC.光电倍增管160-700nm1个光电子可产生106～107个电子分光光度计的主要类型单光束型双光束型光电二极管阵列型（DAD)•1标准曲线法其方法是先配制一系列浓度不同的标准溶液，用选定的显色剂进行显色，在一定波长下分别测定它们的吸光度A。以A为纵坐标，浓度c为横坐标，绘制A-c曲线，若符合朗伯—比尔定律，则得到一条通过原点的直线，称为标准曲线。然后用完全相同的方法和步骤测定被测溶液的吸光度，便可从标准曲线上找出对应的被测溶液浓度或含量，这就是标准曲线法。在仪器、方法和条件都固定的情况下，标准曲线可以多次使用而不必重新制作，因而标准曲线法适用于大量的经常性的工作。二、分光光度测定的方法BlankStandardSampleSample00.10.20.30.40.50.60.70.8024681012Concentration(ug/mL)Abs•2.标准对照法(直接比较法)将试样溶液和一个标准溶液在相同条件进行显色、定容，分别测出它们的吸光度，按下式计算被测溶液的浓度。k标=k测b标=b测所以要求A与c线性关系良好，被测样品溶液与标准溶液浓度接近，以减少测定误差。用一份标准溶液即可计算出被测溶液的含量或浓度，方便，操作简单。标标标测测测标测bckbckAA标标测测ccAA3．吸光系数法在没有标准品可供比较测定的条件下，按文献规定条件测定被测物的吸光度，从样品的配制浓度、测定的吸光度及文献查出的吸光系数即可计算样品的含量，因为则样品含量bcAa样%100abc%100a标标样Aa例9-4已知维生素B12在361nm条件下a标=20.7L·g－1·cm－1。精确称取样品30mg，加水溶解稀释至1000mL，在波长361nm下，用1.00cm吸收池测得溶液的吸光度为0.618，计算样品维生素B12的含量。解：A=a样bc则维生素B12的含量=1)1000/30(618.0bcaA样116.20cmgL%5.99%10020.7.620一、显色反应要求这种被测元素在某种试剂的作用下，