第七章真菌的分子生物学鉴定方法

第七章真菌的分子生物学鉴定方法真菌的形态特征复杂，而且形态特征和生理生化指标随着环境的变化而不稳定，因此，在传统的真菌分类中常引起分类系统不稳定或意见分歧。随着生物化学、遗传学以及分子生物学等相关学科的发展，同时也是真菌分类学自身发展的客观需求，在真菌的现代分类学中引入了分子生物学的鉴定方法。例——捕食线虫真菌的分类发展节丛孢隔指孢单顶孢粘球和非收缩环收缩环菌网粘性分枝分子生物学鉴定方法包括DNA碱基组成(G+C)mol%、限制性片段长度多态性（RFLP）、随机扩增多态性(RAPD)、Southerm印迹分析脉冲电场凝胶电泳（PFGE）以及小亚基rDNA(或rRNA)序列测定等。过去依赖形态和生理生化等表型特征描述逐渐引入分子生物学鉴定方法，按其亲缘关系和客观的反映系统发育的规律对真菌进行自然分类，达到人们追求已久的自然分类目的，无疑是分类学发展过程中的重要转折。一、真菌DNA碱基组成的分类鉴定方法G＋Cmol%测定：使用DNA中（G＋C）摩尔百分比的测定来作为真菌分类的一个技术方法是基于DNA含有四种碱基，不同的有机体（G＋C）：（A＋T）的摩尔百分比却各不相同，每个有机体的G＋Cmol%均有较稳定的值。大量的研究表明，脊椎动物(G+C)mol%为35%—45%，细菌为24%—78%，真菌为20%—60%。在使用G＋Cmol%作为真菌分类的一个指标时，必须注意的是两个有机体的DNA碱基组成相同，而其DNA序列上可以有很大的不同，只有当它们也具有大量共同的表型性状，或在遗传结构方面也彼此相近时，才能说它们在遗传学和进化关系上相近。(G+C)mol%在真菌分类鉴定中主要有两种作用：（1）有助于界定真菌的种、属真菌的各种、属、纲、门之间都有其特定的DNA(G+C)mol%范围，遗传关系相近的有机体有相似的DNA(G+C)mol%。两个菌株之间(G+C)mol%差别在4%—5%之间，可以认为是同一种内的不同株；若差别在10%—15%之间，可以认为是同属内不同的种；差别在20%—30%之间，则认为是不同属或不同科内的真菌。（2）可以作为判定真菌科属间的亲缘关系的参考标准。(G+C)mol%其主要作用在于否定，即(G+C)mol%不相同的菌，肯定回答它们不是同种，而(G+C)mol%相同的菌，就不能肯定回答是同种，只有当它们同时具有大量共同的的表型性状时，才能说明它们的遗传学和亲缘关系上相近。二、核酸分析技术核酸分析技术大都以DNA同源性为基础，这就为那些具有表型特征相似的菌株在分子水平上给以界定。一般而言，同一种内的菌株必须是DNA同源性≥70%。核酸分析技术已经在细菌分类中被广泛应用，而且近年来已被真菌学家们采用。（一）DNA分子杂交技术所有生物体都是以DNA的形式通过碱基序列来贮存遗传信息，不同的生物碱基序列都不同，种的差别越大，其DNA碱基序列差别越大。因此，通过不同真菌DNA碱基同源性分析，可以对真菌种、属间的亲缘关系做出分析鉴定。对大量DNA样品进行全序列分析，从实践的角度仍然是相当困难的，然而，DNA片段杂交可以得到DNA之间核苷酸顺序的互补程度，从而推断不同真菌基因组之间的同源性。变性的单链DNA在一定条件下可以靠碱基的配对而复性成双链，这就是DNA杂交的基本原理。同种异株的真菌基因组DNA序列差异较小，一般认定在35%以内。（二）真菌线粒体DNA限制性片段长度多态性（RFLP）分析限制性片段长度多态性分析（restrictionfragmentlengthpolymorphism,RFLP），将目标DNA序列经一定数目和种类的限制性内切酶(RE)进行酶切,由于不同生物体的基因组DNA在限制性内切酶的酶切位点的遗传信息有差异,限制性内切酶在其上的识别位点的数目和距离就发生了改变，产生一些大小不等的DNA片段。RFLP分析已经被有效用于真菌种及种以下类群的系统学研究、群体水平的变异分析及菌系鉴定，很少用于较高级分类群的系统学研究。（三）随机扩增多态性DNA（RAPD）分析随机扩增DNA多态性分析（randomlyamplifiedpolymorphicDNARAPD）又称随机引物多聚酶链式反应(ArbitraryPrimerPolymeraseChainReactionAP-PCR)是Williams等与Welsh和McClelland于1990年分别同时创立的一种相同的DNA分子标记技术。它应用短的随机序列引物（一般为10个碱基）,在对研究对象的遗传背景一无所知的条件下以DNA为模板进行ＰＣＲ扩增,结果基因组的许多位点同时得以扩增，再应用凝胶电泳分析ＰＣＲ产物,并检测基因多个位点的多态性。RAPD技术是群体遗传研究、菌物鉴定等的很好的分子标记，已经被成功地用于动物、植物、人和微生物的遗传多样性检测、基因定位、品系鉴定、医学诊断、遗传图谱构建和系统学研究等。在分析生物间系统发育关系、分析突变以及亲缘关系鉴定等方面显示出卓越的功能,一些表型上不能反映的遗传物质的细微变化都可以通过RAPD技术显示出来。RAPD是一种比较精细的分子标记技术，单个碱基的改变有可能对扩增片断的多态性产生明显的影响。国内有人利用RAPD对白色念珠菌、淋球菌、水稻白叶枯病菌进行分型取得了很好的结果。黄勃等人利用RAPD技术对拟青霉属菌株进行分类鉴定时，发现RAPD指纹图谱在拟青霉属不同种间具有明显的种的特异性，可以区别所有形态近似的种类，但对比RAPD聚类树状图与基于ITS构建的分子系统发育图，表明该聚类树状图不适于分析种间亲缘关系。三rDNA序列分析的方法及应用基因序列在生物进化过程中的改变速率是一定的，目前很多真菌学家在真菌分子系统学研究的基本方法之一是对菌体的某一段DNA序列进行同源性比较,构建系统树,以此探讨它们的系统演化关系。目前现有的序列资料,常用于真菌系统学研究的基因片段主要有线粒体基因组和rDNA序列。线粒体基因组为双链环状结构，进化速率比核基因组快，一般用于种内及种间的系统分析。真菌编码的18S、28S和5.8S核糖体基因为多拷贝基因家族，有高度相似的DNA序列，每个重复单元由转录区和非转录区组成。非转录区被基因间隔区（intergenicspacerIGS）打断，转录区由两个内转录间隔区（internaltranscribedspacer，ITS）打断，ITS将18S、5.8S和28SrDNA分开。《真菌字典》由国际真菌学研究的权威机构————英国国际真菌研究所出版《DICTIONARYofTHEFUNGI》TrichodermaPers.(1794),anamorphicHypocrea,34(esp.insoil),widespread.Sometimesofuseforcontrollingpathogenicfungi(seeantagonism).SeeRifai(Mycol.Pap.116,1969:Key),Bissett(CJB62:924,1984;Keytosect.Longibrachiatum),Hayesetal.(Anal.Biochem.209:176,1993;methodsforkaryotyping),………….Lieckfeldtetal.(Appl.Environm.Microbiol.65:2418,1999;T.viride).SeeHypocrea.OrbiliaFr.(1849),Orbiliaceae,AnamorphsArthrobotrys,Dactylella,Dicranidion,Dwayaangam,Helecoon,Monacrosporium,Trinacrium,c.34(onwoodetc.,sometimesnematode-trapping),widespread.SeeBaral(SA13:113,1994;concept),Bennyetal.(CJB56:2006,1978;biol.)GenebankData:荷兰的霉菌中心保藏所：