第四章色谱分离技术

第四章色谱分离技术色谱分离技术，又称色层分离技术、层析技术、层离技术等，是20世纪初发展起来的一种分离技术，其分离精度高、设备简单、操作方便，根据各种原理进行分离的色谱法不仅普遍应用于物质成分的定量分析与检测，而且广泛应用于生物物质的制备分离和纯化，是生物下游加工过程获得高纯度产物最重要、最有效的纯化技术。第一节色谱分离技术发展1903年茨维特（M.S.Tsweet）利用活性碳酸钙与石油醚的共同作用把叶绿素分离呈现出不同颜色的色谱带。茨维特把上述分离方法叫做色谱(chromatography)。Itisveryinstructivetoobservetheadsorptionphenomenaduringfiltrationthroughapowder.Firstacolourless,thenayellow（carotene）liquidflowsoutfromthebottomofthefunnel,whileabrightgreenringformsatthetopoftheinulincolumn,belowwhichayellowringsoonappears.Onsubsequentwashingoftheinulincolumnwithpureligroin,bothrings,thegreenandtheyellow,areconsiderablywidenedandmovedownthecolumn.M.S.TswettTr.Varshav.Obshch.Estestvoispyt.,Otd.Biol.,14（1903）20然而，在20多年时间里，他的新分离方法并没有受到科学界的重视。其中一个重要原因是当时的科学家对色谱法的排斥和不信任，认为它不适用于制备工作，在吸附过程中，试样组分可能发生化学变化，并且认为色谱法只能在试样很少的情况下使用，不适合于制备目的……当时的观点，即过分强调制备工作，也反映出当时有机化学家的一种普遍态度。因此，茨维特的技术是超越其时代的。1930年12月，奥地利22岁研究生E.Lederer到海得堡R.Kuhn领导的化学研究所研究类胡萝卜素。他对文献进行了仔细考察，从文献中了解到茨维特的色谱技术。在Kuhn的指导下，他用碳酸钙作吸附剂，在一小色谱柱中，成功地分离了α-、β-、γ-胡萝卜素，并发表了三篇论文，公布了他们的研究成果。这标志着色谱法的兴起。Karrer在1937年，Kuhn在1938年，Ruzicka在1939年相继获诺贝尔化学奖。从此以后，色谱法得到普遍的公认，成为最有效的分离提纯手段。1941年A.J.P.Martin和R.L.M.Synge发明了分配色谱法（partitionchromatography）。1952年获诺贝尔化学奖。1941年Martin和Synge提出用气体代替液体作流动相的可能性。1952年James和Martin发表了从理论到实践比较完整的气液色谱法gas-liquidchromatography。1957年Golay开创了开管柱气相色谱法open-tubularcolumnchromatography，即毛细管柱气相色谱法capillarycolumnchromatography。1956年VanDeemter等在前人研究的基础上发展了描述色谱过程的速率理论。1965年Giddings总结和发展了前人的色谱理论。1944年R.Consden、A.H.Gorden和Martin等发展了纸色谱。1949年Macllean等在氧化铝中加入淀粉粘合剂制作薄层板使薄层色谱法（thinlayerchromatography）得以实际应用，1956年E.Stahl对TLC的标准化、规范化及应用面做了大量工作并开发出薄层色谱板涂布器之后，才使TLC得到广泛地应用。1959年Porath和Flodin提出了凝胶色谱法（gelchromatography）。1967年Porath、Axen和Ernback成功地创立了亲和色谱法（affinitychromatography）。20世纪60年代初，Giddings将气-液色谱理论用于液-液色谱，同时把高压泵和化学键合固定相用于液相色谱，于60年代末出现了高效液相色谱（HPLC）。20世纪80年代初毛细管超临界流体色谱（SFC）得到发展，90年代未得到较广泛的应用。20世纪80年代初由Jorgenson等集前人经验而发展起来的毛细管电泳（Capillaryelectrophoresis，CE），在90年代得到广泛的发展和应用。同时集HPLC和CE优点的毛细管电色谱在20世纪90年代后期受到重视。色谱法的特点优点：“三高”、“一快”缺点：第二节色谱分离原理一、色谱分离的原理利用混合物中各组分的物理、化学性质的差别，使各组分以不同程度分布在两相(固定相、流动相)中达到分离。固定相(Stationaryphase)：是色谱的基质，可以是固体物质（如吸附剂、凝胶、离子交换剂等），也可以是液体物质（如固定在硅胶或纤维素上的溶液），这些物质能与待分离的化合物进行可逆的吸附、溶解、交换等作用。流动相(Mobilephase)：在色谱分离过程中，推动固定相上待分离的物质朝着一个方向移动的液体、气体等。二、色谱技术的类型1、按两相所处的状态分类2、按固定相形状分类柱色谱（columnchromatography）纸上色谱（paperchromatography）薄层层析（thinlayerchromatography）纸色谱或薄层层析操作过程：（1）点样：先用铅笔划原线和原点。用毛细管或微量注射器点样。（2）平衡平衡：是指展开前将滤纸与层析缸用溶剂系统的蒸汽加以饱和的过程。（3）展开平衡后，将点样一端浸入展开剂中。按溶剂在滤纸上流动方向的不同，展开方式可分为三种：①上升法（上行法）：最常用②下降法（下行法）③环行法（水平法）以上方法中，当溶剂前沿到达滤纸另一端5mm处时，表示展开完毕，取出滤纸，晾干。（4）显色如果组分有色，可得到有色斑点，则不需显色。当组分无色时，需要显色。一般有两种显色方法：①紫外光显色法②显色剂显色法用化学试剂作显色剂，以显示组分斑点的位置。注：显色后斑点易褪色，应立即用铅笔描出斑点位置。3、按使用领域不同对色谱仪的分类（1）分析用色谱仪又可分为实验室用色谱仪、在工业生产流程中为在线连续使用的色谱仪和便携式色谱仪。（2）制备用色谱仪又可分为实验室用制备型色谱仪和工业用大型制造纯物质的制备色谱仪。制备型色谱仪可以完成一般分离方法难以完成的纯物质制备任务，如纯化学试剂的制备，蛋白质的纯化。4、根据操作压力不同进行分类可分为低压色谱分离（＜0.5MPa）、中压色谱分离（0.5～5MPa）和高压色谱分离（5～50MPa）。低压色谱分离的装置比较简单，操作费用低，但流动相流动速率慢，分离时间长，常常使生物活性物质活性降低。高压色谱分离技术的特点是，流动相流动速率高，分离时间短，分辨率高。缺点是设备费昂贵，此外在高压作用下有些生物物质有变性的可能。5、根据展开方式进行分类根据洗脱操作时展开方式的不同可分为为洗脱展开（elutiondevelopment）、迎头分析（frontalanalysis）和顶替展开（displacementdevelopment）三种。（1）洗脱展开（elutionchromatography）（2）迎头分析法与一般的固定床吸附操作相同，大量料液连续输入到色谱柱中，直到在出口处发生溶质穿透（breakthrough）。迎头分析中各个溶质按其在固定相和流动相间分配系数的大小次序穿透，只有最先穿透的（分配系数最小）的组分能以纯粹的状态得到部分回收，之后的流出液均为双组分或双组分以上的混合物。（3）顶替展开与洗脱展开相似，唯一不同之处是：顶替展开所采用的洗脱液（流动相）中含有与固定相的亲和力比料液中各个组分都大的物质，这种物质称为顶替剂（displacer）。顶替剂将料液中所含溶质按其与固定相亲和力的大小不同从柱中次序顶替（洗脱）出来。顶替展开法可使溶质区带得到浓缩，适于大量处理稀溶液。6、根据流动方式进行分类一般色谱操作中流动相从固定床的一端输入，沿轴向流向另一端，属于轴向流色谱（axisflowchromatography）。径向流色谱（radialflowchromatography）是在柱心设一通透性细管，料液及流动相从柱的圆周引入，从外表面沿径向流向柱心，透过中心管流出。连续环状色谱（continuousannularchromatography）拟移动床色谱（simulatedmovingbedchromatography）7、按作用机理分类（1）吸附色谱法（2）分配色谱法（3）离子交换色谱法（4）凝胶色谱法（空间排阻色谱法）（5）亲和色谱（6）电色谱（1）吸附色谱法（Adsorptionchromatography，AC）分离机制：各组分与流动相分子争夺吸附剂表面活性中心利用吸附剂对不同组分的吸附能力差异而实现分离吸附→解吸→再吸附→再解吸→无数次洗脱→分开吸附作用力可以是物理吸附作用，也可以是化学吸附作用。物理吸附的特点是选择性低，吸附速度较快，吸附过程可逆；化学吸附的特点是有一定选择性，吸附速度较慢，不易解吸。物理吸附和化学吸附可以同时发生，在一定条件下也可以互相转化。吸附色谱是各种色谱分离技术中应用最早的一类，传统的吸附色谱以各种无机材料为吸附剂。在此基础上发展起来的新的吸附色谱技术，如疏水作用色谱（hydrophobicinteractionchromatography，HIC）、金属螯合作用色谱（metalchelationchromatography，MCC）和共价作用色谱（covalentinteractionchromatography，CIC）等，所用吸附剂一般为有机基质并通过化学修饰后制成，它们都有比较明确的作用机理，即疏水作用、螯合作用和共价作用。（2）分配色谱（Distributionchromatography，DC）分离机制：利用组分在流动相和固定相间溶解度差别实现分离。分离实质：连续萃取过程固定相：机械吸附在惰性载体上的液体流动相：必须与固定相互为不溶载体：惰性，性质稳定，不与固定相和流动相发生化学反应分配系数：注：K与组分的性质、流动相的性质、固定相的性质以及柱温有关分配色谱可分为正相色谱（normalphasechromatography，NPC）和反相色谱（reversedphasechromatography，RPC）正相色谱：固相极性、流动相非极性适合分离极性物质反相色谱：固相非极性、流动相极性适合分离非极性或弱极性物质（3）离子交换色谱（ionexchangechromatography，IEC）分离机制：依据被测组分与离子交换剂交换能力（亲和力）不同而实现分离。固定相：离子交换树脂流动相：水为溶剂的缓冲溶液被分离组分：离子型的有机物或无机物阳离子交换树脂RSO3-H++X+→RSO3-X++H+选择性系数注：Ks与离子的电荷数、水合离子半径、流动相性质、离子交换树脂性质以及温度有关（4）凝胶色谱（gelchromatography，GC）分离机制：利用被测组分分子大小不同、在固定相上选择性渗透实现分离。固定相：多孔性凝胶流动相：水（凝胶过滤色谱）流动相：有机溶剂（凝胶渗透色谱）渗透系数注：Kp仅取决于待测分子尺寸和凝胶孔径大小，与流动相的性质无关（5）亲和色谱（affinitychromatography，AFC）分离机制：是将与目的产物具有特异亲和力的生物分子固定化后作为固定相从混合物中分离目的产物的过程。（6）电色谱（electrochromatography）是电泳和液相色谱的融合技术。所谓电色谱是采用电渗流来推动流动相，使得峰扩展只与溶质扩散系数有关，因而使电色谱的理论塔板数远远高于液相色谱。同时由于引入了高效液相色谱的固定相，使电色谱具备了高效液相色谱固定相所具有的选择性，使