滇池浮游细菌群落组成的空间分布特征及其与环境因子的关系

书书书第３１卷第２期２０１１年２月环　境　科　学　学　报　ＡｃｔａＳｃｉｅｎｔｉａｅＣｉｒｃｕｍｓｔａｎｔｉａｅＶｏｌ．３１，Ｎｏ．２Ｆｅｂ．，２０１１基金项目：国家水体污染控制与治理科技重大专项（Ｎｏ．２００８ＺＸ０７５２６００２０６）ＳｕｐｐｏｒｔｅｄｂｙｔｈｅＮａｔｉｏｎａｌＫｅｙＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓＲ＆ＤＰｒｏｇｒａｍｏｎＷａｔｅｒＰｏｌｌｕｔｉｏｎＣｏｎｔｒｏｌａｎｄＭａｎａｇｅｍｅｎｔｏｆＣｈｉｎａ（Ｎｏ．２００８ＺＸ０７５２６００２０６）作者简介：吕明姬（１９８５—），女，Ｅｍａｉｌ：[e-mail]；通讯作者（责任作者），Ｅｍａｉｌ：[e-mail]：ＬＭｉｎｇｊｉ（１９８５—），ｆｅｍａｌｅ，Ｅｍａｉｌ：[e-mail]；Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇａｕｔｈｏｒ，Ｅｍａｉｌ：[e-mail]吕明姬，汪杰，范铮，等．２０１１．滇池浮游细菌群落组成的空间分布特征及其与环境因子的关系［Ｊ］．环境科学学报，３１（２）：２９９３０６ＬüＭＪ，ＷａｎｇＪ，ＦａｎＺ，ｅｔａｌ．２０１１．ＴｈｅｓｐａｔｉａｌｖａｒｉａｔｉｏｎｓｏｆｂａｃｔｅｒｉｏｐｌａｎｋｔｏｎｃｏｍｍｕｎｉｔｙｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｉｎＬａｋｅＤｉａｎｃｈｉａｎｄｔｈｅｉｒｒｅｌａｔｉｏｎｔｏｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌｆａｃｔｏｒｓ［Ｊ］．ＡｃｔａＳｃｉｅｎｔｉａｅＣｉｒｃｕｍｓｔａｎｔｉａｅ，３１（２）：２９９３０６滇池浮游细菌群落组成的空间分布特征及其与环境因子的关系吕明姬１，汪杰２，范铮３，黄艺１，１．北京大学环境科学与工程学院，北京１００８７１２．北京大学深圳研究生院环境与能源学院，深圳５１８０５５３．北京科技大学土木与环境工程学院，北京１０００８３收稿日期：２０１００６１０　　　修回日期：２０１００８１２　　　录用日期：２０１００８２６摘要：为探讨滇池湖体浮游细菌群落组成的空间分布特征，并找出影响浮游细菌群落组成分布的主要影响因子，通过１６ＳｒＲＮＡ末端限制性片段长度多态性（ＴＲＦＬＰ）分析手段研究了滇池湖体夏季由北向南９个采样点浮游细菌的群落结构．结果表明，９个采样点共得到５２个不同的片段（ＴＲＦｓ），且每种片段至少代表一种细菌．各采样点浮游细菌群落的组成不同，并且优势菌也发生了变化，但９个采样点的ＳｈａｎｎｏｎＷｅｉｎｅｒ指数和均匀度指数都较低，说明滇池的生态环境已很脆弱．通过聚类（Ｃｌｕｓｔｅｒ）和多维尺度（ＭＤＳ）分析浮游细菌群落的空间分布发现，水质情况相似的采样点其浮游细菌群落组成也相似，并且可将９个采样点的浮游细菌群落组成分为４类．典型相应分析（ＣＣＡ）结果表明，氨氮（ＮＨ＋４Ｎ）、总氮（ＴＮ）、硝氮（ＮＯ－３Ｎ）、叶绿素ａ（Ｃｈｌａ）对浮游细菌的分布影响最大，其次为ｐＨ和温度．关键词：浮游细菌；１６ＳｒＲＮＡＴＲＦＬＰ；空间差异；环境因子；滇池文章编号：０２５３２４６８（２０１１）０２２９９０８　　　中图分类号：Ｘ５２４　　　文献标识码：ＡＴｈｅｓｐａｔｉａｌｖａｒｉａｔｉｏｎｓｏｆｂａｃｔｅｒｉｏｐｌａｎｋｔｏｎｃｏｍｍｕｎｉｔｙｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｉｎＬａｋｅＤｉａｎｃｈｉａｎｄｔｈｅｉｒｒｅｌａｔｉｏｎｔｏｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌｆａｃｔｏｒｓＬＭｉｎｇｊｉ１，ＷＡＮＧＪｉｅ２，ＦＡＮＺｈｅｎｇ３，ＨＵＡＮＧＹｉ１，１．ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＥｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌＳｃｉｅｎｃｅｓａｎｄＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ＰｅｋｉｎｇＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｂｅｉｊｉｎｇ１００８７１２．ＳｃｈｏｏｌｏｆＥｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｎｄＥｎｅｒｇｙ，ＰｅｋｉｎｇＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＳｈｅｎｚｈｅｎＧｒａｄｕａｔｅＳｃｈｏｏｌ，Ｓｈｅｎｚｈｅｎ５１８０５５３．ＣｏｌｌｅｇｅｏｆａｎｄＣｉｖｉｌａｎｄＥｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙＢｅｉｊｉｎｇ，Ｂｅｉｊｉｎｇ１０００８３Ｒｅｃｅｉｖｅｄ１０Ｊｕｎｅ２０１０；　　　ｒｅｃｅｉｖｅｄｉｎｒｅｖｉｓｅｄｆｏｒｍ１２Ａｕｇｕｓｔ２０１０；　　　ａｃｃｅｐｔｅｄ２６Ａｕｇｕｓｔ２０１０Ａｂｓｔｒａｃｔ：ＬａｋｅＤｉａｎｃｈｉｉｓｉｎａｓｅｒｉｏｕｓｅｕｔｒｏｐｈｉｃａｔｉｏｎｓｔａｔｅ．Ｈｏｗｅｖｅｒ，ｔｈｅｗａｔｅｒｑｕａｌｉｔｙｖａｒｉｅｓｓｐａｔｉａｌｌｙｉｎｔｈｅｌａｋｅ．Ｉｎｏｒｄｅｒｔｏｅｘｐｌｏｒｅｔｈｅｓｐａｔｉａｌｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎｏｆｂａｃｔｅｒｉｏｐｌａｎｋｔｏｎｃｏｍｍｕｎｉｔｙｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ（ＢＣＣｓ），ａｓｗｅｌｌａｓｔｏｉｄｅｎｔｉｆｙｔｈｅｋｅｙｆａｃｔｏｒｓｔｈａｔａｆｆｅｃｔｔｈｅｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎｏｆＢＣＣｓ，９ｓｕｒｆａｃｅｗａｔｅｒｓａｍｐｌｅｓｗｅｒｅｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｄａｌｏｎｇｔｈｅｔｒｏｐｈｉｃｇｒａｄｉｅｎｔｉｎｔｈｅｓｕｍｍｅｒｏｆ２００９ｂｙｔｅｒｍｉｎａｌｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎｆｒａｇｍｅｎｔｌｅｎｇｔｈｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ（ＴＲＦＬＰ）．Ｉｎｔｏｔａｌ，ｆｉｆｔｙｔｗｏｔｅｒｍｉｎａｌｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎｆｒａｇｍｅｎｔｓ（ＴＲＦｓ）ｗｅｒｅｄｅｔｅｃｔｅｄｉｎａｌｌｓａｍｐｌｅｓ．Ｔｈｅｎｉｎｅｓａｍｐｌｅｓｈａｄｄｉｆｆｅｒｅｎｔｂａｃｔｅｒｉａｌｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓａｎｄｐｒｅｄｏｍｉｎａｎｔｔｙｐｅｓ．ＢｕｔｔｈｅＳｈａｎｎｏｎＷｅｉｎｅｒｄｉｖｅｒｓｉｔｙｉｎｄｉｃｅｓａｎｄｅｖｅｎｎｅｓｓｉｎａｌｌｔｈｅｓａｍｐｌｅｓｗｅｒｅｌｏｗ，ｗｈｉｃｈｉｎｄｉｃａｔｅｄｔｈａｔｔｈｅｅｃｏｌｏｇｉｃａｌｓｔａｔｕｓｏｆＬａｋｅＤｉａｎｃｈｉｗａｓｆｒａｇｉｌｅ．Ｍｕｌｔｉｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌｓｃａｌｉｎｇ（ＭＤＳ）ａｎａｌｙｓｉｓｉｎｄｉｃａｔｅｄｔｈａｔｔｈｅｓａｍｐｌｅｓｔｈａｔｓｃａｔｔｅｒｅｄｃｌｏｓｅｌｙｈａｄｓｉｍｉｌａｒｗａｔｅｒｑｕａｌｉｔｉｅｓ，ｖｅｒｉｆｉｅｄｂｙｃｌｕｓｔｅｒａｎａｌｙｓｉｓｕｓｉｎｇＵＰＧＭＡ（ｕｎｗｅｉｇｈｔｅｄｐａｉｒ－ｇｒｏｕｐｍｅｔｈｏｄｕｓｉｎｇａｖｅｒａｇｅｓ）．Ｍｅａｎｗｈｉｌｅ，ｔｈｅＢＢＣｓｏｆ９ｓａｍｐｌｅｓｃｏｕｌｄｂｅｄｉｖｉｄｅｄｉｎｔｏｆｏｕｒｃｌｕｓｔｅｒｓ．Ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｏｆｃａｎｏｎｉｃａｌｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇａｎａｌｙｓｉｓ（ＣＣＡ）ａｌｓｏｉｌｌｕｍｉｎａｔｅｄｔｈｅｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌｆａｃｔｏｒｓａｆｆｅｃｔｉｎｇｔｈｅＢＣＣ，ａｍｏｎｇｗｈｉｃｈＮＨ＋４Ｎ，ｔｏｔａｌｎｉｔｒｏｇｅｎ，ＮＯ－３ＮａｎｄＣｈｌａｗｅｒｅｔｈｅｍｏｓｔｉｎｆｌｕｅｎｔｉａｌｆａｃｔｏｒｓ，ｔｈｏｕｇｈ，ｐＨａｎｄｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅａｌｓｏｈａｄａｃｅｒｔａｉｎｉｎｆｌｕｅｎｃｅ．Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ｂａｃｔｅｒｉｏｐｌａｎｋｔｏｎ；１６ＳｒＲＮＡＴＲＦＬＰ；ｓｐａｃｅｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ；ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌｆａｃｔｏｒｓ；ＬａｋｅＤｉａｎｃｈｉ１　引言（Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ）浮游细菌不仅数量巨大，而且在有机物降解及营养物循环过程中具有重要作用，是水生态系统的重要组成部分（Ｍｕｙｌａｅｒｔｅｔａｌ．，２００２；Ｗｅｉｅｔａｌ．，２００８）．另外，在水生态系统中，微生物对外部环境环　　境　　科　　学　　学　　报３１卷的变化非常敏感（Ｐａｅｒｌｅｔａｌ．，２００３）．因此，作为对外部环境变化最灵敏的响应，浮游细菌群落组成的改变能在一定程度上反映该水环境的状态．目前，越来越多的研究开始关注浮游细菌与环境因子之间的关系（Ｄｏｎｎｅｒｅｔａｌ．，１９９６；Ｌｉｎｄｓｔｒｍ，２００１；Ｌｉｕｅｔａｌ．，２００９）．但是，由于浮游细菌与环境因子之间的关系较为复杂，大多研究至今仍处于摸索阶段（Ｖｉｅｉｒａｅｔａｌ．，２００８）．同时，针对严重富营养化湖泊内浮游细菌群落与环境因子之间关系的研究报道也相对较少．滇池位于昆明市西南，属断陷构造湖泊，是云贵高原湖面积最大的淡水湖．近年来，由于城市化进程的飞速发展，大量含有高浓度氮、磷等营养物的污染物排入滇池，使得整个湖泊的富营养化问题十分严重．尽管如此，滇池内不同湖区的水质情况却不尽相同．研究发现，由南至北，滇池的富营养水平不同（Ｘｉｎｇｅｔａｌ．，２００５；Ｃａｉ，２００９）．基于此，本文应用末端限制性酶切片段长度多态性分析（ＴＲＦＬＰ）手段，对滇池内不同湖区水体中浮游细菌群落组成进行研究，探讨浮游细菌群落组成的空间分布差异．同时，通过典型相应分析（ＣＣＡ）研究浮游细菌群落的组成与环境因子的关系，以期找出影响浮游细菌群落组成分布的关键因子，为富营养化水体的生态环境修复提供基础信息和理论依据．２　材料和方法（Ｍａｔｅｒｉａｌｓａｎｄｍｅｔｈｏｄｓ）２．１　样品采集２００９年８月，于滇池草海（Ｄ１和Ｄ２）和外海（Ｄ３～Ｄ９）采集实验样品，共９个样点，分别为断桥（Ｄ１）、草海中心（Ｄ２）、灰湾中（Ｄ３）、罗家营（Ｄ４）、观音山西（Ｄ５）、观音山东（Ｄ６）、白鱼口（Ｄ７）、海口西（Ｄ８）、滇池南（Ｄ９）（图１）．于每个样点（距水面０．２～０．３ｍ处）取１．６Ｌ表层水，分装在４个已灭菌的玻璃瓶中，其中两瓶用于测定各项水质指标，另外两瓶用于ＴＲＦＬＰ研究．所取水样立刻运往实验室，于４℃黑暗保存，且所有样品都在一周内进行分析．２．２　ＤＮＡ提取４００ｍＬ水样经０．２２μｍ微孔滤膜过滤后，将截留有微生物的滤膜于－２０℃保存．在超净台用灭菌的剪刀将滤膜剪成碎片装入离心管中，采用上海申能博彩试剂盒提取过滤后水样中的总ＤＮＡ，具体方图１　采样点布图Ｆｉｇ．１　Ｍａｐｏｆｔｈｅｓａｍｐｌｅｓｉｔｅｓ法参照试剂盒产品说明书．每个样品所采的两瓶水样（每瓶含水样４００ｍＬ）平行提取ＤＮＡ．２．３　１６ＳｒＲＮＡ片段的ＰＣＲ扩增和ＴＲＦＬＰ分析用于ＴＲＦＬＰ分析的引物为细菌通用引物２７ｆ（５′ＡＧＡＧＴＴＴＧＡＴＣＭＴＧＧＣＴＣＡＧ３′）和１４９２ｒ（５′ＧＧＴＴＡＣＣＴＴＧＴＴＡＣＧＡＣＴＴ３′），正向引物２７ｆ的５′端用ＦＡＭ荧光素标记．采用２５μＬ的ＰＣＲ反应体系：１２．５μＬ２×ＴａｑＰＣＲＭａｓｔｅｒＭｉｘ（天根公司），２μＬ合成的正反引物（赛百盛公司），３μＬＤＮＡ模板，５．５μＬｄｄＨ２Ｏ．反应条件如下：９４℃预变性５ｍｉｎ；９４℃变性３０ｓ，５５℃退火３０ｓ，７２℃延伸９０ｓ，共３０个循环；最终７２℃延伸５ｍｉｎ．对于一个样点，分别以上述２个ＤＮＡ提取产物为模板进行ＰＣＲ扩增，且每个模板都设６个ＰＣＲ重复，以降低ＰＣＲ的偏好性和假象．９个样点共设１０８（２×６×９）个ＰＣＲ体系．ＰＣＲ扩增产物用０．８％琼脂糖凝胶电泳检测．然后，将６个ＰＣＲ产物混合，按照天根纯化试剂盒的操作步骤对混合产物进行纯化，纯化后的产物采用限制性内切酶ＨａｅＩＩＩ（赛百盛公司）进行酶切，反应体系如下：３μＬ限制性内切酶，３μＬ缓冲液，ＰＣＲ产物１５μＬ．酶切后，６５℃水浴灭活１５ｍｉｎ．酶切产物送至上海基康公司进行测定．每个样点最后得到２个ＴＲＦＬＰ图谱．００３２期吕明姬等：滇池浮游细菌群落组成的空间分布特征及其与环境因子的关系２．４　ＴＲＦＬＰ图谱预处理对于每个图谱，去掉荧光强度低于１００ＲＦＵ和长度小于５０ｂｐ的片段，将剩下片段的峰面积进行标准化处理，并去除相对丰度小于１％的片段，将长度小于１ｂｐ的片段并在一起．将每个样点的两个ＴＲＦＬＰ图谱进行比对，去掉只在一个图谱中出现的片段．２．５　水质指标的测定现场测定水温（Ｔ），其他水质指标，如溶解氧（ＤＯ）、溶解有机碳（ＤＯＣ）、总氮（ＴＮ）、总磷（ＴＰ）、氨氮（ＮＨ＋４Ｎ）、硝氮（ＮＯ－３Ｎ）、叶绿素ａ（Ｃｈｌａ）、透明度（ＳＤ）的测定都参照国家环保部的标准方法（ＧＢ３８３８２００２）．２